इस प्रोटोकॉल का वर्णन murine atria के electrophysiological मूल्यांकन एक उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ एक ऑप्टिकल मानचित्रण प्रणाली का उपयोग, झिल्ली वोल्टेज और Ca के दोहरी रिकॉर्डिंग सहित2 + क्षणिक के तहत क्रमादेशित एक विशेष इलेक्ट्रोड कैथेटर के माध्यम से उत्तेजना ।
हाल ही में जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन लक्ष्यीकरण अलिंद अलिंद (वायुसेना) phenotype में जीनोटाइप और electrophysiological atria के बीच एक मजबूत संघ का संकेत दिया है । कि हमें प्रोत्साहित करने के लिए एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल का उपयोग करने वायुसेना के तंत्र स्पष्ट । हालांकि, यह उनके छोटे आकार के कारण murine atria में electrophysiological गुणों का मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल है । इस प्रोटोकॉल Langendorff perfused murine दिलों में एक उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ एक ऑप्टिकल मानचित्रण प्रणाली का उपयोग atria के electrophysiological मूल्यांकन का वर्णन करता है । ऑप्टिकल मानचित्रण प्रणाली दोहरी उच्च गति पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक कैमरों और उच्च इज़ाफ़ा उद्देश्य लेंस के साथ इकट्ठे है, एक वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई और सीए2 + संकेतक के प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए । murine atria के आकलन पर ध् यान देने के लिए, ऑप्टिकल मानचित्रण 2 मिमी × 2 मिमी या 10 मिमी x 10 मिमी के एक क्षेत्र के साथ किया जाता है, एक १०० × १०० संकल्प के साथ (20 µm/पिक्सेल या १०० µm/पिक्सेल) और अधिकतम पर 10 kHz (०.१ ms) के लिए नमूना दर । एक 1-फ्रांसीसी आकार quadripolar इलेक्ट्रोड पेसिंग कैथेटर बेहतर वेना कावा के लिए किसी भी यांत्रिक क्षति से बचने के माध्यम से सही atrium में रखा गया है, और atrium उत्तेजना कैथेटर के माध्यम से दिया जाता है । एक electrophysiological अध्ययन लगातार पेसिंग, फट पेसिंग सहित क्रमादेशित उत्तेजना के साथ किया जाता है, और ट्रिपल extrastimuli पेसिंग तक । एक सहज या पेसिंग लय के तहत, ऑप्टिकल मानचित्रण कार्रवाई संभावित अवधि, सक्रियकरण नक्शा, आचरण वेग, और Ca2 + क्षणिक व्यक्तिगत रूप से सही और बाएं atria में दर्ज की गई । इसके अलावा, क्रमादेशित उत्तेजना भी अलिंद tachyarrhythmias के inducibility निर्धारित करता है । सटीक सक्रियकरण मैपिंग एक प्रेरित अलिंद tachyarrhythmia के दौरान atrium में उत्तेजना के प्रचार की पहचान करने के लिए किया जाता है । एक विशेष सेटिंग के साथ ऑप्टिकल मानचित्रण murine रोग मॉडल में atrium की एक पूरी तरह से electrophysiological मूल्यांकन सक्षम बनाता है ।
दिल स्तनधारियों में 4 कक्षों के होते हैं । ऊपरी दो कक्ष atria हैं, और निचले लोगों निलय हैं । निलय प्रणालीगत या फेफड़े के संचलन के लिए रक्त बेदखल करने के लिए एक पंप के रूप में काम करते हैं । Atria प्रणालीगत या फेफड़े की नसों से लौट रक्त प्राप्त करते हैं, और निलय में रक्त परिवहन में सहायता करने के लिए एक कुशल कार्डियक पंप समारोह प्राप्त करते हैं । एक electrophysiological पहलू से, atria का महत्वपूर्ण कार्य दिल ताल को विनियमित करने के लिए है । विद्युत संकेतों बेहतर वेना कावा (SVC) और सही atrium (आरए) के बीच जंक्शन पर स्थित साइनस नोड से शुरू, तो रा और वाम atrium (LA) के लिए प्रचार, और अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक नोड के माध्यम से निलय के लिए आचरण और अपने-Purkinje आचरण प्रणाली ।
ताल विकारों, जो दिल ताल विकार हैं, उनके मूल के अनुसार अलिंद और वेंट्रिकुलर में वर्गीकृत कर रहे हैं । अलिंद अलिंद (वायुसेना) एक अतालता का सबसे आम निरंतर रूप है, atria की एक यादृच्छिक और तेजी से उत्तेजना की विशेषता । हाल ही में आनुवंशिक विश्लेषण और जीनोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन (GWAS) वायुसेना और आनुवंशिक उत्परिवर्तनों या monopolymorphisms1,2,3,4के बीच सहयोग से पता चला है । इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है वायु सेना के एक आनुवंशिक कारण से जुड़ा हुआ है । इसलिए, यह एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर पशु मॉडल का उपयोग कर atria में जीनोटाइप-phenotype बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह व्यापक रूप से स्वीकार किया है कि माउस आनुवंशिक संशोधन के लिए सबसे स्थापित स्तनधारियों है ।
हार्ट टिशू के उत्तेजना का मूल्यांकन करने के लिए ऑप्टिकल मैपिंग तकनीक विकसित की गई है । हालांकि, ऑप्टिकल मानचित्रण द्वारा murine atrium के प्रेक्षण अपने अपेक्षाकृत छोटे आकार से प्रभावित है । हम एक उच्च लौकिक और स्थानिक संकल्प के साथ murine atrium का एक विस्तृत मूल्यांकन प्राप्त करने का प्रयास ।
ऑप्टिकल मानचित्रण कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी7का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित पैंतरेबाज़ी है, और न केवल वेंट्रिकुलर अतालता8,9का आकलन करने के लिए एक काफी उपयोगी उपकरण है, लेकिन यह भी अलिंद लोगों को10,11 . transmembrane क्षमता और सीए2 + यात्रियों के एक साथ मानचित्रण दिल की विफलता और अन्य हृदय रोगों के संबंध में अतालता के अंतर्निहित तंत्र को समझने के लिए उपयोगी है12,13. जब अंय electrophysiological मूल्यांकन विधियों, जैसे उन एक एकल कक्ष या कक्ष पत्रक, perfused दिल में ऑप्टिकल मानचित्रण के निरपेक्ष श्रेष्ठताओं में से एक का उपयोग कर की तुलना बरकरार atrium में आचरण पैटर्न का आकलन है और निलय, न केवल साइनस लय के दौरान, लेकिन यह भी प्रेरित अतालता14के दौरान. एक प्रयास murine दिल का उपयोग करने के लिए, विशेष रूप से atrium, मानव के एक किराए के रूप में मुख्य रूप से उनके छोटे आकार के कारण कठिनाई का सामना करना पड़ा है, तथापि, माउस एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर पशु में मूल्यांकन के मामले में एक आकर्षक प्रयोगात्मक मॉडल है मॉडल, और इस समस्या को दूर किया जाना चाहिए । हमारा दृष्टिकोण इसे हल करने के लिए एक दिशा प्रदान करता है ।
हालांकि हमारे ऑप्टिकल मानचित्रण तंत्र मूल रूप से पूरे murine दिल के लिए पारंपरिक प्रणाली के समान था15, हमारे विधि यह करने के लिए कुछ संशोधनों के द्वारा murine atrium का आकलन करने का लाभ है । सबसे पहले, हम अप करने के लिए एक उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प प्राप्त करने के लिए ०.१ ms/फ़्रेम और 20 µm/पिक्सेल, और इस उच्च संकल्प मानचित्रण murine atrium में आचरण वेग और प्रचार पैटर्न का एक और अधिक सटीक माप के लिए योगदान दिया । दूसरा, किसी भी अनावश्यक यांत्रिक क्षति या atrium, जो electrophysiological गुणों को बदल सकता है की खिंचाव से बचने के लिए 16,17, एक निवास सुई सीधे LV में अंतर चैंबर दबाव को कम करने के लिए डाला जाता है, इसके बजाय ला के माध्यम से इसे डालने के रूप में पिछले अध्ययन में प्रदर्शन किया15। इसके अलावा, पेसिंग उत्तेजना के माध्यम से दिया जाता है एक कस्टम बनाया 1-फ्रेंच आकार इलेक्ट्रोड कैथेटर रा में रखा है, लेकिन एक सुई इलेक्ट्रोड द्वारा नहीं, जो atrium घायल हो सकता है. किसी भी पिन अलिंद संलग्न है, जो पिछले अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था फिक्सिंग में बचा रहे हैं15. तीसरे, ताल विकारों के अंतर्निहित तंत्र के आकलन के संदर्भ में, एक क्रमादेशित उत्तेजना प्रोटोकॉल अलिंद tachyarrhythmias प्रेरित करने के लिए18,19महत्वपूर्ण है । हम नैदानिक electrophysiological अध्ययन, फट पेसिंग और ट्रिपल extrastimuli पेसिंग, माउस दिल के लिए पेसिंग अंतराल के एक संशोधन के साथ शामिल करने के लिए समान उत्तेजना क्रमादेशित करते हैं । इस प्रकार, आधारभूत मापन मापदंडों के अतिरिक्त, प्रोटोकॉल inducibility का मूल्यांकन कर सकता है. जरूरत पड़ने पर inducibility के isoproterenol या अन्य दवाओं का प्रशासन के साथ आकलन किया जाता है । हमारे अनुभव में, जंगली प्रकार के चूहे शायद ही कोई एटीएस एक पूर्ण उत्तेजना प्रोटोकॉल के बाद भी दिखा । इस प्रकार, inducibility के आनुवंशिक उत्परिवर्तनों, शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं, और दवाओं के प्रशासन के रूप में कई रोग स्थितियों के योगदान के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण जानकारी होनी चाहिए11. उन संशोधनों को बरकरार murine atrium में सटीक electrophysiological आकलन का अनुकूलन सकता है ।
इस विधि की भी कुछ सीमाएं हैं । सबसे पहले, एक 5x उद्देश्य लेंस के साथ एक अधिकतम स्थानिक संकल्प का उपयोग करना, देखने के क्षेत्र (FOV) atrium के एक भाग (यानीकेवल बाईं अलिंद संलग्न के रूप में चित्रा 2aमें दिखाया गया है) तक ही सीमित है । atrium का बड़ा FOV प्राप्त करने के लिए, एक 1.6 x उद्देश्य लेंस कभी-कभार बेहतर होता है (चित्र b) । दूसरा, पिन के साथ atrium फिक्सिंग के बिना, कई बार यह अलिंद आचरण गुणों को सही ढंग से मापने के लिए मुश्किल है, क्योंकि अलिंद सतह घुमावदार है । तो, हम इसके बजाय यह पिन से फिक्सिंग के समतल करने के लिए इसकी सतह पर कवर गिलास रखा । इस विधि समाधान के कंपन से गति विरूपण साक्ष्य को रोकने के लिए भी फायदेमंद है । तीसरा, हमारे विधि के साथ, यह बहुत मुश्किल है कि यह पूरी FOV प्राप्त करने के लिए, तो, पूर्वकाल और पीछे देखने का उपयोग करने के लिए ठीक से अंय दृष्टिकोण में अधिक से अधिक हमारे दृष्टिकोण में महत्वपूर्ण है के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है । पूर्वकाल देखने का लाभ रोग की स्थिति के मामले में फिर से प्रवेश के स्पष्ट अवलोकन होगा, विशेष रूप से संलग्न (चित्रा 4) । दूसरी ओर, पीछे देखने के अलिंद पीछे दीवार का एक अच्छा दृश्य प्राप्त करने का एक फायदा है, और रोधगलन आस्तीन से ट्रिगर गतिविधि की एक विस्तृत रिकॉर्डिंग हो सकता है । जब यह एक उचित दृश्य प्राप्त करने के लिए और हमारे विधि के साथ अपनी घुमावदार सतह समतल करने के लिए मुश्किल है, atrium पिन द्वारा न्यूनतम तनाव के साथ तय किया जा सकता है.
हमारे विधि के साथ, वहां रहे है 3 संभावित समस्याओं, धुंधला, पेसिंग, और अतालता प्रेरण की विफलता । धुंधला की विफलता के लिए, यदि कोई या मामूली प्रतिदीप्ति है, तो आप की जांच करनी चाहिए कि ऑप्टिकल मानचित्रण तंत्र सही ढंग से इकट्ठे है, और कि क्या एजेंट उचित और संग्रहीत किया जाता है । छिड़काव समाधान की स्थिति भी महत्वपूर्ण है, जो भी दिल के electrophysiological गुण ही प्रभावित कर सकते हैं, तो, पीएच, तापमान सहित समाधान की स्थिति है, और क्या वहां पर्याप्त था वातन करने के लिए सख्ती से निगरानी की है । दिल में किसी भी एयर emboli से बचना भी जरूरी है । पेसिंग विफलता के लिए, यदि पेसिंग उत्तेजनाओं atrium उत्तेजित नहीं कर सकते, शोधकर्ताओं की जांच करनी चाहिए कि तारों एक सर्किट परीक्षक का उपयोग सही है । जब पेसिंग उत्तेजनाओं सही ढंग से कर रहे हैं, समस्या ऊतक के साथ इलेक्ट्रोड के संपर्क है । इलेक्ट्रोड का जमाव समस्या को हल कर सकते हैं, और पेसिंग कैथेटर का उपयोग कर हमारे दृष्टिकोण यह आसान बनाता है. अतालता प्रेरण में कठिनाई के लिए, आर. वी. पेसिंग कुछ सीमित मामलों में एक पर प्रेरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक quadripolar इलेक्ट्रोड कैथेटर का उपयोग करना जिसमें से बाहर दो इलेक्ट्रोड और समीपस्थ इलेक्ट्रोड rv और ra में स्थित हो सकते हैं, क्रमशः, यह पेसिंग साइट रा से rv करने के लिए परिवर्तित करने के लिए आसान है । यह कैथेटर भी वेंट्रिकुलर उत्तेजना स्थानांतरण के लिए उपयोगी है जब एक साथ वेंट्रिकुलर सक्रियण संकेत मास्क अलिंद उत्तेजना संकेत ।
इस विधि GWAS जैसे उपंयास अध्ययन द्वारा हाल ही में पाया वायुसेना संबंधित जीन में जीनोटाइप-phenotype बातचीत का आकलन करने में योगदान होगा, विशेष रूप से जीन जिसके साथ जांच के लिए उंहें अंय दृष्टिकोण से दिखाने में विफल रहे । उपकरणों और तकनीकों की प्रगति के साथ, फुफ्फुसीय नस आस्तीन के electrophysiological गुण, जो वायुसेना20का महत्वपूर्ण स्रोत है, इस दृष्टिकोण के साथ अक्षुण्ण हृदय में मूल्यांकन किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम विज्ञान और प्रौद्योगिकी (एससीएफ) को बढ़ावा देने के लिए विशेष समंवय कोष से युवा शोधकर्ताओं के लिए अनुसंधान पर्यावरण के सुधार के लिए कार्यक्रम के द्वारा समर्थित है (T.S.), अनुदान में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (no. 16K09494, T.S., नहीं २६२९३०५२ के लिए, to T.F.) जापान के शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी (MEXT) मंत्रालय से । हम तकनीकी सहायता के लिए Brainvision और श्री केंजी Tsubokura की सराहना करते हैं, और हम भी उनकी भाषाई सहायता के लिए श्री जॉन मार्टिन की सराहना करते हैं ।
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |