Denne protokollen beskriver elektrofysiologiske evaluering av murine atria bruker en optisk kartsystem med en høy timelige og romlig oppløsning, inkludert to innspillinger av membran spenning og Ca2 + forbigående under programmert stimulering gjennom et kateter, spesialiserte elektroden.
Genomet hele association-studier som målretting atrieflimmer (AF) har vist en sterk sammenheng mellom genotype og elektrofysiologiske fenotypen i atria. Som oppfordrer oss til å utnytte en genmodifiserte musemodell for å belyse mekanismen av AF. Det er imidlertid vanskelig å vurdere elektrofysiologiske egenskapene i murine atria på grunn av sin lille størrelse. Denne protokollen beskriver elektrofysiologiske evaluering av atria bruker en optisk kartsystem med en høy timelige og romlig oppløsning i Langendorff perfused murine hjerter. Optisk representasjon er montert med dobbelt høyhastighets complementary metal Oxice semiconductor kameraer og forstørring målet linser, å oppdage fluorescens spenning-sensitive fargestoff og Ca2 + indikator. For å fokusere på vurdering av murine atria, utføres optisk kartlegging med et areal på 2 mm × 2 mm eller 10 mm x 10 mm, med 100 × 100 oppløsning (20 µm/bildepunkt eller 100 µm/bildepunkt) og samplingsfrekvens på opptil 10 kHz (0,1 ms) ved maksimal. En 1-fransk størrelse quadripolar elektrode pacing kateter plasseres i høyre atrium gjennom den overlegne vena cava unngå mekanisk skade atrium, og pacing stimulering leveres gjennom kateter. En elektrofysiologiske studie utføres med programmert stimulering inkludert konstant pacing, brast pacing, og tre extrastimuli pacing. Under spontane eller pacing rytme, registrert optisk tilordningen handling potensial varighet, aktivisering kart, ledning hastighet og Ca2 + forbigående enkeltvis i de høyre og venstre atria. I tillegg bestemmer programmert stimulering også inducibility av atrial tachyarrhythmias. Presis aktivisering tilordningen utføres for å identifisere utbredelsen av magnetisering i atriet under en indusert atrial tachyarrhythmia. Optisk kartlegging spesialiserte omgivelser gjør en grundig elektrofysiologiske evaluering av atriet i murine patologisk modeller.
Hjertet består av 4 kamre i pattedyr. Øvre kinesere er atria lavere seg er ventriklene. Ventriklene fungere som en pumpe å kaste ut blod til systemisk eller lunge sirkulasjon. Atria får blodet returnerer fra systemisk eller lunge venene og hjelpe transport blod i ventriklene å få en effektiv cardiac pumpe funksjon. Fra en elektrofysiologiske aspektet er atria viktig funksjon å regulere hjerterytmen. De elektriske signalene kommer fra noden sinus ligger i krysset mellom overlegen vena cava (SVC) og høyre atrium (RA), deretter overføres til RA og venstre atrium (LA), og gjennomføre til ventrikkel gjennom atrioventricular node og hans-Purkinje ledning system.
Arytmier, som hjerte rytme lidelser, klassifiseres i atrial og ventrikkel i henhold. Atrieflimmer (AF) er den vanligste vedvarende en arytmi, preget av en tilfeldig og rask magnetisering av atria. Siste genetiske analyser og genom hele association studier (GWAS) har vist tilknytningen mellom AF og genetiske mutasjoner eller monopolymorphisms1,2,3,4. Disse funnene tyder AF er minst delvis forbundet med en genetisk årsak. Derfor er det avgjørende å vurdere genotype-fenotypen samhandlinger i atria ved hjelp av genmodifiserte dyr modell. Det er allment akseptert at musen er det mest etablerte pattedyret for genetisk modifisering.
Den optiske kartlegging teknikken som er utviklet for å evaluere magnetisering av hjertet tissue. Imidlertid er observasjon av murine atrium by optisk kartlegging hindret av den relativt lille størrelsen. Vi prøver å oppnå en detaljert vurdering av murine atrium med høy timelige og romlig oppløsning.
Optisk kartlegging er et veletablert manøvrere for å studere cardiac elektrofysiologi7, og er et nyttig verktøy for å vurdere ikke bare ventrikulær arytmi8,9, men også atrial de10,11 . Samtidige tilordning av transmembrane potensial og Ca2 + transienter er nyttig for å forstå de underliggende mekanismene arytmi hjertesvikt og andre hjertesykdommer12,13. Når du sammenligner de andre elektrofysiologiske vurdering metodene, som de som bruker en enkelt celle eller cellen ark, en av de absolutte superiorities av optisk kartlegging i perfused hjertet er vurdering av ledning mønster i intakt atriet og ventrikkel, indusert ikke bare under sinus rytme, men også under arytmi14. Et forsøk på å utnytte murine hjerter, spesielt atrium, som et surrogat av mennesker har oppstått problemer med hovedsakelig på grunn av sin lille størrelse, men musen er en attraktiv eksperimentell modell i vurderingen i en genmodifiserte dyr modell, og problemet må overvinnes. Vår tilnærming gir en retning for å løse den.
Selv om vår optisk kartlegging apparater var i utgangspunktet lik konvensjonelle systemet for hele murine hjerter15, har våre metoden fordelen av å vurdere murine atriet ved å gjøre noen endringer. Først fulgte vi for å få en høy romlig og tidsmessige oppløsning til 0,1 ms/ramme og 20 µm/bildepunkt og denne høyoppløselig tilordningen bidratt til en mer presis måling av varmeledning hastighet og forplantning mønsteret i murine atriet. Andre for å unngå unødvendige mekanisk skade eller strekning av atrium, som kan endre elektrofysiologiske egenskaper 16,17, settes en iboende nålen direkte inn LV å redusere intra-kammer trykk, i stedet for å sette det gjennom LA som utføres i forrige studere15. Videre pacing stimulans leveres gjennom en tilpasset gjort 1-fransk størrelse elektrode kateter plasseres i RA, men ikke av en pinne elektrode, som kan skade atriet. Noen pinner unngås i innfesting atrial appendage, som ble brukt i tidligere studier15. Tredje i vurdering av den underliggende mekanismen av arytmi er programmert stimulering å indusere atrial tachyarrhythmias en avgjørende18,19. Vi utfører programmert stimulering identisk i kliniske elektrofysiologiske studier, inkludert burst pacing og trippel extrastimuli pacing, med en endring av pacing intervallet for musen hjertet. Således, i tillegg til planlagte måling parameterne, protokollen kan vurdere inducibility av AT. Ved behov, vurderes inducibility av AT med administrasjonen av isoproterenol eller andre stoffer. I vår erfaring viser det vill-type mus knapt noen ATs selv etter en full stimulering protokoll. Dermed bør inducibility av AT være viktig informasjon for å vurdere bidrag av flere pathological betingelser som genetiske mutasjoner, kirurgiske prosedyrer og administrasjon av narkotika11. Disse endringene kan optimalisere presis elektrofysiologiske vurdering i intakt murine atriet.
Denne metoden har også noen begrensninger. Først bruker maksimal romlig oppløsning med en 5 X linsen, synsfelt (FOV) er begrenset til en del av atrium (dvs. bare venstre atrial appendage som vist i figur 2a). For å få den større FOV av atrium, er en 1,6 X linsen ofte å foretrekke (figur 2b). Andre uten feste atriet med pinner, er noen ganger det vanskelig å måle egenskapene atrial ledning riktig, fordi atrial overflaten er buet. Så plassert vi dekket glasset på overflaten å flate det istedet for bestemmer det av pinnene. Denne metoden er også gunstig for å forebygge bevegelse gjenstand fra vibrasjoner av løsningen. Tredje vår metoden, er det ganske vanskelig å få den hele FOV, så du bruker visningen fremre og bakre riktig er viktigere i vår tilnærming enn i andre tilnærming som vist i figur 2. Fordelen med visningen fremre ville være klart observasjon av reentry ved pathological betingelser, spesielt i appendage (Figur 4). På den annen side, bakre visningen har en fordel av å få en god utsikt over atrial bakre veggen, og kan være en detaljert innspilling av utløsende aktivitet fra hjerteinfarkt ermet. Når det er vanskelig å få et riktig visning og flat buet overflaten med vår metode, kan atrium være fast med minimal spenning av pinnene.
Med vår metode er det 3 mulige problemer, feil flekker, pacing og arytmi induksjon. Svikt i flekker, hvis ingen eller liten fluorescens er observert, bør du sjekke om optisk kartlegging apparatet er riktig montert, og om reagensen er riktig lagret og brukes. Tilstanden av perfusjon løsningen er også avgjørende, som også kan påvirke elektrofysiologiske egenskapene til hjertet selv, så tilstanden til løsning inkluderer pH, temperatur, og om det var nok lufting må følges strengt. Det er også viktig å unngå noen luft emboli i hjertet. For pacing feil, hvis pacing stimuli ikke opphisse atrium, bør forskere sjekke om ledninger er riktig bruker krets tester. Når pacing stimuli er riktig produseres, er problemet kontakt av elektroden med vevet. Omplassering av elektrodene kan løse problemet, og vår tilnærming med pacing kateter gjør det enkelt. For problemer med arytmi induksjon, kan RV pacing brukes for induksjon av en AT begrenset iblant. Bruke et quadripolar elektrode kateter som den distale to elektroder og proksimale elektrodene kan plasseres i RV og RA, henholdsvis, er det enkelt å endre pacing området fra RA til RV. Denne kateter er også nyttig for skiftende ventrikkel magnetisering når et samtidig ventrikkel aktivering signal masker atrial eksitasjon signalet.
Denne metoden vil bidra til å vurdere genotype-fenotypen interaksjoner i AF relatert gener nylig funnet av romanen studiene som GWAS, spesielt for gener som etterforskningen kunne vise dem av andre tilnærminger. Med utviklingen av enheter og teknikker, kan elektrofysiologiske egenskaper for pulmonary blodåre ermet, som er det viktig AF20, vurderes i intakt hjertet med denne tilnærmingen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av programmet for forbedring av forskningsmiljø for unge forskere fra koordinering midler for å fremme vitenskap og teknologi (SCF) (til T.S.), Grants-in-Aid for vitenskapelig forskning (nr. 16K 09494, T.S., nr. 26293052, til T.F.) fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT) i Japan. Vi verdsette Brainvision og Mr. Kenji Tsubokura for teknisk assistanse, og vi setter også pris Mr. John Martin for hans språklige hjelp.
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |