Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de atria murino utilizando un sistema de mapeo óptico con una alta resolución espacial y temporal, incluyendo grabaciones duales de la tensión de la membrana y Ca2 + transitoria bajo programado estimulación a través de un catéter electrodo especializados.
Estudios recientes de la asociación a fibrilación auricular (FA) han indicado una fuerte asociación entre el genotipo y el fenotipo electrofisiológico en las aurículas. Nos anima a utilizar un modelo de ratones genéticamente modificados para aclarar el mecanismo de AF. Sin embargo, es difícil evaluar las propiedades electrofisiológicas de murinos aurículas debido a su pequeño tamaño. Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de aurículas usando un sistema de mapeo óptico con alta resolución temporal y espacial en corazones murino Langendorff inundada. El sistema de mapeo óptico está montado con cámaras de semiconductor de óxido metálico complementaria alta velocidad dual y alta magnificación lentes del objetivo, para detectar la fluorescencia de un tinte sensible a la tensión y un indicador de Ca2 + . Para centrarse en la evaluación de atria murino, mapeo óptico se realiza con un área de 2 x 2 mm o 10 mm x 10 mm, con un 100 × 100 de resolución (μm/píxeles 20 o 100 μm/píxeles) y velocidad de muestreo de hasta 10 kHz (0,1 ms) máximo. Se coloca un electrodo tetrapolar de tamaño 1-French catéter de marcapasos en la aurícula derecha a través de la vena cava superior, evitando cualquier daño mecánico a la aurícula, y estimulación estimulación se entrega a través del catéter. Se realiza un estudio electrofisiológico con estimulación programada, incluyendo la estimulación constante, la explosión estimulación y hasta tres extraestímulos estimulación. En una espontánea o ritmo de marcapasos, el mapeo óptico registró la duración del potencial de acción, mapa de activación, velocidad de conducción y Ca2 + transitoria individualmente en las aurículas derecha e izquierdas. Además, la estimulación programada determina también la inducibilidad de taquiarritmias auriculares. Asignación precisa de la activación se realiza para identificar la propagación de la excitación en el atrio durante una taquiarritmia atrial inducida. Mapeo óptico con un entorno especializado permite una completa evaluación electrofisiológica del atrio en modelos murinos de patológicos.
El corazón consta de 4 cámaras en los mamíferos. Las dos cámaras superiores son atria, y los inferiores son los ventrículos. Ventrículos trabajan como una bomba para expulsar la sangre a la circulación sistémica o pulmonar. Aurículas reciben sangre de las venas sistémicas o pulmonares y ayudar en el transporte de sangre a los ventrículos para obtener una función eficiente de la bomba cardiaca. Desde un aspecto electrofisiológico, la importante función de las aurículas es regular el ritmo cardíaco. Las señales eléctricas se originan desde el nodo sinusal ubicado en el cruce de la vena cava superior (SVC) y la aurícula derecha (RA), entonces propagan a la RA y la aurícula izquierda (AI) y conducta al ventrículo a través del nodo auriculoventricular y His-Purkinje sistema de conducción.
Arritmias, que son trastornos del ritmo cardiaco, se clasifican en auricular y ventricular según su origen. Fibrilación auricular (FA) es la forma más común sostenida de una arritmia, caracterizada por una excitación rápida y al azar de las aurículas. Recientes análisis genéticos y estudios de Asociación de genoma completo (GWAS) han demostrado la asociación entre AF y mutaciones genéticas o monopolymorphisms1,2,3,4. Estos resultados indican que AF es por lo menos en parte relacionado con una causa genética. Por lo tanto, es fundamental para evaluar las interacciones genotipo-fenotipo en las aurículas mediante un modelo de animales genéticamente modificados. Es ampliamente aceptado que el ratón es el mamífero más establecido para la modificación genética.
La técnica de mapeo óptico ha sido desarrollada para evaluar la excitación del tejido del corazón. Sin embargo, la observación del atrio murino por mapeo óptico se ve obstaculizada por su tamaño relativamente pequeño. Se pretende lograr una evaluación detallada del atrio murino con una alta resolución temporal y espacial.
Mapeo óptico es una maniobra bien establecida para el estudio de la electrofisiología cardiaca7y es una herramienta muy útil para evaluar no solo las arritmias ventriculares8,9, sino también la10,11 . Asignación simultánea del potencial transmembrana y transitorios de Ca2 + es útil para la comprensión de los mecanismos subyacentes de arritmias en relación con la insuficiencia cardíaca y otras enfermedades del corazón12,13. Cuando se comparan los otros métodos de evaluación electrofisiológica, como aquellos que utilizan una sola celda o capa celular, una de las superioridades absolutas del mapeo óptico en el corazón inundado de es la evaluación del patrón de conducción en la aurícula intacto y ventrículo, durante ritmo sinusal, pero también durante las arritmias inducidas14. Un intento de utilizar corazones murino, especialmente el atrio, como sustituto de los seres humanos ha encontrado dificultades debido principalmente a su pequeño tamaño, sin embargo, el ratón es un modelo experimental atractivo en términos de la evaluación en un animal genéticamente modificados modelo y este problema deben ser superada. Nuestro enfoque proporciona una dirección para resolverlo.
Aunque nuestro aparato óptico asignación era básicamente similar al sistema convencional de corazones todo murino15, nuestro método tiene la ventaja de evaluar el atrio murino haciendo algunas modificaciones a la misma. En primer lugar, nos persiguió para obtener una alta resolución espacial y temporal de hasta 0,1 ms/marco y 20 μm/píxeles y esta alta resolución asignación contribuido a una medición más precisa del patrón de propagación y velocidad de conducción en el atrio murino. En segundo lugar, para evitar cualquier daño mecánico innecesario o estiramiento de la aurícula, que podría alterar las propiedades electrofisiológicas 16,17, se inserta una aguja residente directamente en el LV para reducir la presión intra-cámara, en lugar de insertar a través de LA ya realizada en el anterior estudio15. Además, el estímulo estimulación se entrega a través de un catéter electrodo tamaño por encargo 1-francés en la RA, pero no por un electrodo de aguja, que puede lesionar el atrio. Las patas son evitadas en la fijación de la orejuela, que fueron utilizadas en el pasado estudio15. En tercer lugar, en cuanto a la evaluación del mecanismo subyacente de las arritmias, un protocolo de estimulación programada para inducir taquiarritmias atriales es crucial18,19. Realizamos idéntica a la del estímulo programado en estudios electrofisiológicos clínicos, incluyendo explosión estimulación y hasta tres extraestímulos estimulación, con una modificación del intervalo de estimulación para el corazón de ratón. Así, además de los parámetros de medición de línea de base, el protocolo podría evaluar la inducibilidad de la AT. Cuando sea necesario, la inducibilidad de la AT se evalúa con la administración de isoproterenol u otras drogas. En nuestra experiencia, los ratones de tipo salvaje apenas mostrar cualquier ATs incluso después de un protocolo de estimulación completo. Así, la inducibilidad de AT debe ser información importante para evaluar la contribución de varias condiciones patológicas tales como las mutaciones genéticas, procedimientos quirúrgicos y la administración de medicamentos11. Estas modificaciones podrían optimizar la precisa evaluación electrofisiológica en el atrio murino intacto.
Este método también tiene algunas limitaciones. En primer lugar, con una resolución espacial máxima de un objetivo de 5 X, el campo de visión (FOV) está limitada a una parte del atrio (es decir. solamente la orejuela auricular izquierda como se muestra en la Figura 2a). Para obtener el mayor FOV del atrio, un 1.6 X objetivo es a veces preferible (figura 2b). En segundo lugar, sin con los pernos de fijación el atrio, a veces resulta difícil medir las propiedades de conducción auricular correctamente, porque se curva la superficie auricular. Por lo tanto, colocamos el cristal en su superficie a aplanar en el lugar de fijación por pernos. Este método también es beneficioso para la prevención de artefactos de movimiento de las vibraciones de la solución. En tercer lugar, con nuestro método, es muy difícil de obtener el campo visual entero, por lo tanto usar correctamente la vista anterior y posterior es más importante para nuestro enfoque que en el otro enfoque como se muestra en la figura 2. La ventaja de la vista anterior sería la clara observación de reingreso en el caso de condiciones patológicas, especialmente en el apéndice (figura 4). Por otra parte, la vista posterior tiene la ventaja de obtener una buena vista de la pared posterior auricular y puede ser una grabación detallada de desencadenar la actividad de la manga miocardio. Cuando es difícil obtener una visión adecuada y para aplanar su superficie curvada con nuestro método, el atrio se puede fijar con tensión mínima de pernos.
Con nuestro método, existen 3 posibles problemas, la falta de coloración, estimulación e inducción de arritmia. Para la falta de coloración, si no hay o leve fluorescencia es observada, se debe comprobar si el aparato de mapeo óptico esté montado correctamente, y si se almacena y utiliza apropiadamente el reactivo. La condición de la solución de perfusión también es crucial, que también pueden afectar las propiedades electrofisiológicas del corazón sí mismo, por lo tanto, la condición de solución incluyendo el pH, temperatura, y si hay suficiente aireación tiene que ser estrictamente monitoreados. También es importante evitar cualquier aire émbolos en el corazón. Por falta de estimulación, si los estimulación estímulos no pueden excitar el atrio, los investigadores deben comprobar si el cableado es correcto usando un probador de circuito. Cuando los estímulos estimulación se generan correctamente, el problema es el contacto del electrodo con el tejido. Reposicionamiento de los electrodos puede resolver el problema, y nuestro enfoque mediante el catéter de estimulación hace que sea fácil. Por dificultad en la inducción de la arritmia, RV estimulación puede utilizarse para la inducción de un AT en algunos casos limitadas. Utilizando una sonda de electrodo tetrapolar que el distales dos electrodos y electrodos proximal se encuentra en la RV y la RA, respectivamente, es fácil cambiar el sitio de estimulación de la RA a la RV Este catéter también es útil para cambiar la excitación ventricular cuando una señal de activación ventricular simultánea enmascara la señal de excitación auricular.
Este método contribuirá a evaluar el genotipo-fenotipo las interacciones en la AF relacionada con genes encontrados recientemente por los estudios novedosos como GWAS, especialmente para los genes con que la investigación no pudo demostrar por otros métodos. Con el progreso de técnicas y dispositivos, las propiedades electrofisiológicas de la manga de la vena pulmonar, que es la fuente importante de AF20, pueden ser evaluadas en el corazón intacto con este enfoque.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo es apoyado por el programa para la mejora del entorno de investigación para jóvenes investigadores de fondos especiales de la coordinación para promoción de ciencia y tecnología (SCF) (a T.S.), subvenciones para la investigación científica (no. 16K 09494, T.S., Nº 26293052, a T.F.) desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología (MEXT) de Japón. Agradecemos Brainvision y Sr. Kenji Tsubokura de la asistencia técnica, y también apreciamos el Sr. John Martin por su ayuda lingüística.
(-)-Blebbistatin | SIGMA | B0560-1MG | E-C decoupler to eliminate motion artifact during optical mapping |
RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
Rhod2AM | Biotium | 50024 | Ca indicator |
Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Biotium | #59000 | To enhance the staining with Rhod2AM |
Di-4-ANEPPS | Wako | 041-29111 | Voltage-sensitive dye |
Dimethyl sulfoxide | Wako | 046-21981 | Solvent for reagents |
Bottle top filter | Corning | 430513 | For filtering Tyrode's solution |
Haparin Sodium | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd | N/A | To avoid blood clots in the coronary artery |
Air stone (φ8 mm x 10 mm) | Tokyo Koshin Rikagaku Seisakusho | N/A | for aeration |
Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku Corporation | N/A | For an anesthesia |
Programmable stimulator | Fukuda Denshi | BC-05 | Fukuda Denshi kindly rented us. |
Power Lab | AD Instruments | Powerlab 26/8SP | To record blood pressure and electrocardiogram |
Bio Amp | AD Instruments | ML132 | Amprifier for electrocardiogram |
BP Amp | AD Instruments | FE117 | Amprifier for blood pressure |
LabChart | AD Instruments | Version 7 | Software to record and analyze blood pressure and electrocardiogram |
Disposable BP transducer | AD Instruments | MLT0670 | pressure transducer |
1-Fr custom made electrode catheter | Unique Medical | N/A | To pace right atrium |
Polyethylene tube (OD: 0.8 mm, ID: 0.5 mm) | Natume Seisakujo | SP31 | Put into superior vena cava to introduce electrode catheter |
Millex-SV 5.00 μm | Merk Millipore | SLSV025LS | To filter the circulating Tyrode |
24-gauge indwelling needle | TERUMO | SR-FS2419 | Introduced into left ventricle to reduce the pressure in chamber |
21-gauge needle | TERUMO | SN-2170 | We cut the tip of needle and blunted it by filing |
25-guage needle | TERUMO | NN-2525R | |
1-ml syringe | TERUMO | SS-01T | |
PVC tube | TERUMO | SF-ET0525 | for Langendorff's perfusion circuit |
Three-way stopcock | TERUMO | TS-TL2K | for Langendorff's perfusion circuit |
Petri dish | As one | 3-1491-01 | |
Custum made heating glass coil | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Custum made warming glass chamber | Motohashi Rika | N/A | to keep temperature of perfusion solution |
Constant temperature circulating device | Lauda | E100 | connected to heating coil and warming chamber |
Cover glass (25 mm × 60 mm) | Matsunami | C025601 | Put on the atria to flatten the recording area |
Perista pump | ATTO | SJ-1211 | peristaltic pump |
Stemi DV4 | Carl Zeiss | N/A | Stereomicroscope |
MiCAM ULTIMA-L2 | Brainvision Inc. | UL-L2 | Optical mapping System |
BV_Ana Software | Brainvision Inc. | BV_Ana | Data Analysis Software |
THT Macroscope | Brainvision Inc. | THT-ZS | Epi-Illumination Unit |
LED Light Source | Brainvision Inc. | LEX2-G | |
Dichroic Mirror 560nm | Brainvision Inc. | DM560 | Epi-Illuminatinon |
Excitation Filter 520/35nm | Semrock, Inc. | FF01-520/35-25 | |
Projection lens Plan S 1.0X | Carl Zeiss | 435200-0000-000 | |
Focus Drive | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Objective lens Revolver | Carl Zeiss | 435302-0000-000 | |
Manual Focus Column | Carl Zeiss | 435400-0000-000 | |
Macroscope Base | Carl Zeiss | 435430-9901-000 | |
Straight Light Guide | MORITEX Corporation | MSG10-2200S | Epi-Illuminatinon |
Condenser Lens | MORITEX Corporation | ML-50 | |
PLANAPO 5.0X | Leica Microsystems | 10447243 | Objective Lens |
PLANAPO 1.0X | Leica Microsystems | 10447157 | Objective Lens |
PLANAPO 1.6X | Leica Microsystems | 10447050 | Objective Lens |
Beam-Splitter | Brainvision Inc. | FLSP-2 | |
Dichroic Mirror 665nm | Brainvision Inc. | DM665 | Beam-Splitter |
Emission Filter 572/28nm | Edmund Optics | #84-100 | Rhod2-AM |
Emission Filter 697/75nm | Semrock, Inc. | FF01-697/75-25 | RH237 and Di-4-ANEPPS |
0.2 mL PCR tube | Greiner Bio-One | 671201 | |
aluminum foil | Toyo alumi | 0020 |