تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من الوصلات العصبية العضلية اليرقات المورفولوجية
Summary
يمكن تسجيل التيارات متشابك فوكالي من تصور boutons متشابك في الوصلات العصبية العضلية يرقات الطور المورفولوجية الثالثة. هذا الأسلوب يتيح رصد نشاط بوتون واحد متشابك.
Abstract
الوصلات العصبية العضلية المورفولوجية (NMJ) نظام نموذجا ممتازا لدراسة انتقال متشابك جلوتاماتيرجيك. يصف لنا هذا أسلوب تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من تصور بتونس في NMJ اليرقات المورفولوجية . يتطلب هذا الأسلوب تلفيق مخصصة لتسجيل ميكروبيبيتيس، فضلا عن مجهر المجمع مجهزة بتكبير عالية والهدف غمر المياه البعيدة المدى والبصريات التباين (DIC) التدخل التفاضلية ونيون مرفق. يتم وضع مسرى التسجيل على رأس بوتون متشابك محدد تصور مع DIC البصريات، وبرنامج التحصين الموسع-الأسفار، أو كليهما. وميزة هذا الأسلوب أنه يتيح رصد النشاط متشابك لعدد محدود من المواقع للإفراج. مسرى التسجيل التي يبلغ قطرها عدة ميكرون، والإفراج عن المواقع المتمركزة خارج حافة القطب لا تؤثر كثيرا على التيارات المسجلة. التيارات متشابك مسجل حركية سريعة ويمكن حلها بسهولة. هذه المزايا ذات أهمية خاصة لدراسات المسخ خطوط الطيران مع تعزيز النشاط متشابك عفوية أو غير متزامن.
Introduction
المورفولوجية نظام نموذجا ممتازا دراسة الآليات الجزيئية السيطرة على انتقال متشابك. النظام العصبي العضلي في المورفولوجية جلوتاماتيرجيك، وذلك يمكن استخدام الوصلات العصبية العضلية المورفولوجية (NMJ) لدراسة ملامح مصانة من الإصدار جلوتاماتيرجيك. منذ يان وجان الدراسة1، استخدمت يرقات الطور الثالث على نطاق واسع لدراسة انتقال متشابك مقولة والعفوية عن طريق رصد إمكانات مفرق ضادات (ايبس) أو التيارات (إيكس). عادة يتم تسجيل ايبس إينتراسيلولارلي مع مايكرو زجاج حادة-قطب كهربائي، وأنها تعكس نشاط NMJ كاملة، بما في ذلك جميع boutons جعل نقاط الاشتباك العصبي في الألياف العضلية معين.
على النقيض من ذلك، يمكن تسجيل النشاط على عدد محدود من المواقع لإطلاق سراح فوكالي عن طريق وضع تلميح ميكروبيبيتي قرب المحطات العصبية أو varicosities متشابك. واستخدمت هذا الأسلوب أصلاً كاتز وميليدي2، والتسجيلات خارج الخلية المحورية قد استخدمت بنجاح في الأعمال التحضيرية NMJ عدة، بما في ذلك الضفدع3،،من45، الماوس6 , 7 , 8و القشريات9،10،11،،من1213،،من1415،16 المورفولوجية17،،من1819،20،21،،من2223. كذلك وضع هذا النهج دوديل، الذين الأمثل إعادة ترميز أقطاب24،25ماكروباتش. في التنفيذ دوديل، تتطابق هذه التقنية طريقة فضفاضة-التصحيح-المشبك26.
NMJ اليرقات المورفولوجية حددت بوضوح boutons متشابك، وخطوط المحورة وراثيا مع العلامات الفلورية العصبية المشفرة جينياً (انظر الجدول للمواد) متوفرة بسهولة. هذه المزايا مكنتنا من تسجيل اجكس وميجكس من21،20،بوتون متشابك محدد22. هنا، يمكننا وصف هذا الأسلوب بالتفصيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
المورفولوجية يمثل كائن نموذج مفيد لدراسة انتقال متشابك. وقد استخدمت العديد من تكوينات التسجيل في NMJ اليرقات، بما في ذلك تسجيلات داخل الخلايا من إمكانات متشابك، تسجيلات تيارات متشابك مع قطب هما الجهد المشبك33،34، والتنسيق ماكروباتش تسجيلات متشابك التيا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تدعمه المنحة R01 MH 099557 المعاهد الوطنية للصحة
Materials
| Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
| Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
| Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
| Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
| TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
| TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
| Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
| Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
| Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
| Quantan | In-house software | – | Software for signal processing |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
| cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | – | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |
Referências
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
- Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).
- Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals. J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).
- Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus). J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).
- Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. Localization of active zones. Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).
- Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens. J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).
- Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals. J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).
- Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse. Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).
- Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals. J Physiol. 383, 587-599 (1987).
- Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium. Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).
- Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction. J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).
- Zucker, R. S. Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses. J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).
- Zucker, R. S. Changes in the statistics of transmitter release during facilitation. J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).
- Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model. J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).
- Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction. J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).
- Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse. Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).
- Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus. J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
- Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. Postfusional control of quantal current shape. Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).
- Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons. Brain Res. 1178, 52-64 (2007).
- Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size. Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).
- Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion. Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).
- Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction. J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).
- Dudel, J. The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction. Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).
- Dudel, J. Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle. Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).
- Marrero, H. G., Lemos, J. R. . Loose-Patch-Clamp method. , (2007).
- Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle. J Vis Exp. (45), (2010).
- Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Imlach, W., McCabe, B. D. Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae. J Vis Exp. (24), (2009).
- Bykhovskaia, M. Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN. J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).
- Huntwork, S., Littleton, J. T. A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth. Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).
- Zhong, Y., Wu, C. F. Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade. Science. 251 (4990), 198-201 (1991).
- Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire. Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).
- Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones. J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).
