מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל
Summary
ניתן להקליט זרמים סינפטית focally מ עם העיתון ons סינפטית מטמיעים בצומת דרוזופילה השלישי לחלל הזחלים עצב-שריר. טכניקה זו מאפשרת פיקוח על הפעילות של בוטון סינפטית יחיד.
Abstract
צומת עצב-שריר דרוזופילה (NMJ) היא מערכת מודל מצויין ללמוד הסינאפסית glutamatergic. אנו מתארים את הטכניקה של מוקד macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מ עם העיתון ons מטמיעים ב- NMJ זחל דרוזופילה . טכניקה זו דורשת מותאם אישית פבריקציה נוספת של הקלטה micropipettes, כמו גם מיקרוסקופ המתחם מצויד בהגדלה גדולה, המטרה טבילה במים למרחקים ארוכים, אופטיקה חדות (DIC) התערבות דיפרנציאלית של פלורסנט קובץ מצורף. האלקטרודה הקלטה ממוקם בחלק העליון בוטון סינפטית שנבחר דמיינו אופטיקה DIC, epi-זריחה, או שניהם. היתרון של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת ניטור פעילות סינפטית של מספר מצומצם של אתרים של שחרור. האלקטרודה ההקלטה יש קוטר של מספר מיקרונים, האתרים שחרור ממוקם מחוץ לקצה אלקטרודה אינם משפיעים באופן משמעותי את הזרמים המוקלט. הזרמים סינפטית מוקלטות יש קינטיקה מהיר, ניתן לפתור בקלות. יתרונות אלה חשובים במיוחד עבור הלימודים של קווי לעוף מוטנטים עם פעילות סינפטית משופרת ספונטני או אסינכרוני.
Introduction
דרוזופילה הוא מערכת מודל מצוין לחקור את המנגנונים המולקולריים שליטה הסינאפסית. מערכת neuromuscular דרוזופילה הוא glutamatergic, ולכן צומת עצב-שריר דרוזופילה (NMJ) יכול לשמש כדי לחקור את התכונות ההכפלה של שחרור glutamatergic. מאז של יאן וג’ן מחקר1, הזחלים לחלל השלישי שימש בהרחבה ללמוד עורר וספונטני הסינאפסית על-ידי ניטור צומת סינאפסות פוטנציאל (EJPs) או זרמי (שלטון). EJPs בדרך כלל נרשמים intracellularly עם מיקרו-אלקטרודת זכוכית חדים, הם משקפים את הפעילות של NMJ כולו, כולל כל עם העיתון ons עושה הסינפסות סיבי השריר נתון.
לעומת זאת, הפעילות של מספר מוגבל של האתרים של שחרור ניתן להקליט focally על-ידי הצבת טיפ micropipette ליד מסופי עצביים או varicosities סינפטית. טכניקה זו במקור מועסק על ידי כץ ו Miledi2, הקלטות חוץ-תאית מוקד יש כבר מועסקים בהצלחה ב מספר הכנות NMJ, כולל צפרדע3,4,5, העכבר6 , 7 , 8, סרטנאים9,10,11,12,13,14,15,16, ו- דרוזופילה17,18,19,20,21,22,23. גישה זו פותחה עוד יותר על ידי Dudel, אשר מותאם במיוחד macropatch recoding אלקטרודות24,25. בהטמעה של Dudel, טכניקה זו התאימה היטב רופף-תיקון-קלאמפ שיטת26.
NMJ זחל דרוזופילה הגדירה בבירור עם העיתון ons סינפטית, קווים הטרנסגניים בתגים מקודדים גנטית פלורסנט עצביים (ראה טבלה של חומרים) זמינים. יתרונות אלה אפשרו לנו להקליט שלטון ו mEJCs מ21,20,22שנבחר בוטון סינפטית. כאן, אנו מתארים את טכניקה זו בפירוט.
Protocol
Representative Results
Discussion
דרוזופילה מייצג אורגניזם מודל יתרון ללמוד הסינאפסית. מספר תצורות הקלטה השתמשו ב- NMJ זחל, כולל הקלטות תאיים של סינאפטיים, הקלטות של זרמי סינפטית עם שתי האלקטרודות מתח קלאמפ33,34, מיקוד macropatch הקלטות של זרמי סינפטית המתוארים כאן. הטכניקה השנייה מאפשרת כימות …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך על ידי המענק-NIH R01 MH 099557
Materials
| Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
| Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
| Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
| Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
| TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
| TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
| Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
| Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
| Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
| Quantan | In-house software | – | Software for signal processing |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
| cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | – | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |
Referências
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
- Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).
- Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals. J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).
- Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus). J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).
- Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. Localization of active zones. Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).
- Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens. J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).
- Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals. J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).
- Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse. Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).
- Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals. J Physiol. 383, 587-599 (1987).
- Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium. Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).
- Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction. J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).
- Zucker, R. S. Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses. J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).
- Zucker, R. S. Changes in the statistics of transmitter release during facilitation. J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).
- Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model. J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).
- Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction. J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).
- Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse. Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).
- Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus. J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
- Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. Postfusional control of quantal current shape. Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).
- Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons. Brain Res. 1178, 52-64 (2007).
- Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size. Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).
- Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion. Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).
- Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction. J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).
- Dudel, J. The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction. Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).
- Dudel, J. Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle. Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).
- Marrero, H. G., Lemos, J. R. . Loose-Patch-Clamp method. , (2007).
- Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle. J Vis Exp. (45), (2010).
- Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Imlach, W., McCabe, B. D. Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae. J Vis Exp. (24), (2009).
- Bykhovskaia, M. Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN. J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).
- Huntwork, S., Littleton, J. T. A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth. Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).
- Zhong, Y., Wu, C. F. Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade. Science. 251 (4990), 198-201 (1991).
- Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire. Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).
- Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones. J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).
