Macropatch focale registrazioni delle correnti sinaptiche da giunzione neuromuscolare larvale della drosofila
Summary
Delle correnti sinaptiche possono essere registrate focale da visualizzati boutons sinaptici alla giunzione neuromuscolare larve instar terza della drosofila . Questa tecnica consente il monitoraggio dell’attività di una singola bouton sinaptica.
Abstract
Drosophila della giunzione neuromuscolare (NMJ) è un sistema eccellente modello per studiare la trasmissione sinaptica glutamatergic. Descriviamo la tecnica delle registrazioni macropatch focale delle correnti sinaptiche da boutons visualizzati alle NMJ larvale della drosofila . Questa tecnica richiede la realizzazione personalizzata di registrazione micropipette, come pure un microscopio composto dotato di un alto ingrandimento, obiettivo a immersione in acqua a lunga distanza, ottica (DIC) contrasto differenziale di interferenza e una fluorescente allegato. L’elettrodo di registrazione è posizionato sulla sommità di una bouton sinaptica selezionata visualizzata con ottica DIC, epi-fluorescenza o entrambi. Il vantaggio di questa tecnica è che permette di monitorare l’attività sinaptica di un numero limitato di siti di rilascio. L’elettrodo di registrazione ha un diametro di alcuni micron, e i siti di rilascio posizionati di fuori del cerchio dell’elettrodo non influenzano significativamente le correnti registrate. Le correnti sinaptiche registrate hanno cinetica veloce e possono essere facilmente risolto. Questi vantaggi sono particolarmente importanti per gli studi di linee mutanti volare con maggiore attività sinaptica spontanea o asincrona.
Introduction
Drosophila è un sistema eccellente modello per studiare i meccanismi molecolari che controllano trasmissione sinaptica. Il sistema neuromuscolare in Drosophila è glutamatergici, e pertanto la drosofila giunzione neuromuscolare (NMJ) può essere utilizzata per studiare le caratteristiche conservate di glutamatergic rilascio. Da Jan e Jan Studio1, le larve instar terza è stato largamente utilizzato per studiare la trasmissione sinaptica spontanea ed evocata da monitoraggio potenziali eccitatori giunzione (giuridiche) o correnti (EJC). Giuridiche sono comunemente registrate intracellulare con un micro-elettrodo di vetro taglienti, e riflettono l’attività di NMJ intera, compresi tutti i boutons fare sinapsi al data fibra muscolare.
Al contrario, l’attività di un numero limitato di siti di rilascio possa essere registrata focale posizionando un suggerimento micropipetta vicino terminali neuronali o varicosità sinaptica. Questa tecnica è stata impiegata originariamente da Katz e Miledi2e focale registrazioni extracellulari sono state impiegate con successo in diverse preparazioni di NMJ, tra cui rana3,4,5, mouse6 , 7 , 8, crostaceo9,10,11,12,13,14,15,16e Drosofila17,18,19,20,21,22,23. Questo approccio è stato ulteriormente sviluppato da Dudel, che ottimizzato macropatch ricodifica elettrodi24,25. Nell’implementazione di Dudel, questa tecnica non si discostano l’ allentato-patch-clamp metodo26.
NMJ larvale Drosophila ha chiaramente definito boutons sinaptici e linee transgeniche con tag fluorescente neuronale geneticamente codificato (Vedi Tabella materiali) sono prontamente disponibili. Questi vantaggi ci ha permesso di registrare EJC e mEJCs da un bouton sinaptico selezionato20,21,22. Qui, descriviamo questa tecnica in dettaglio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila rappresenta un organismo modello vantaggioso per studiare la trasmissione sinaptica. Sono state utilizzate diverse configurazioni di registrazione alle NMJ larvale, tra cui registrazioni intracellulari di potenziali sinaptici, registrazioni di correnti sinaptiche con due elettrodi tensione morsetto33,34e focale macropatch registrazioni di correnti sinaptiche descritte qui. La seconda tecnica permette la quantificazione precisa della trasmissio…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supportato dalla concessione NIH R01 MH 099557
Materials
| Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
| Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
| Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
| Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
| TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
| TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
| Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
| Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
| Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
| Quantan | In-house software | – | Software for signal processing |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
| cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | – | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |
Referências
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