Macropatch focal gravações das correntes sinápticas da junção Neuromuscular Larval da drosófila
Summary
Correntes sinápticas podem ser gravadas focally de boutons sinápticas visualizados na drosófila terceiro ínstar larvas junção neuromuscular. Esta técnica permite monitorar a atividade de um único bouton sináptica.
Abstract
Drosófila junção neuromuscular (JNM) é um sistema excelente modelo para estudar a transmissão sináptica glutamatérgico. Descrevemos a técnica de macropatch focal gravações das correntes sinápticas de boutons visualizados no MNJ larvas de Drosophila . Esta técnica requer a fabricação personalizada de micropipetas, bem como um microscópio composto, equipado com uma alta ampliação, objectivo de imersão de água de longa distância, óptica de interferência diferencial (DIC) de contraste e uma fluorescente de gravação acessório. O eletrodo de gravação está posicionado no topo de um selecionado bouton sináptica visualizado com óptica DIC, epi-fluorescência ou ambos. A vantagem desta técnica é que permite monitorar a atividade sináptica de um número limitado de sítios de lançamento. O eletrodo de gravação tem um diâmetro de vários micra, e os locais de lançamento posicionados fora da borda do eletrodo não afetam significativamente as correntes gravadas. As correntes sinápticas gravadas tem cinética rápida e podem ser facilmente resolvidas. Estas vantagens são especialmente importantes para os estudos de linhas de mosca mutantes com maior atividade sináptica espontânea ou assíncrona.
Introduction
Drosófila é um sistema excelente modelo para estudar os mecanismos moleculares de controle da transmissão sináptica. O sistema neuromuscular em Drosophila é glutamatérgico, e portanto a drosófila de junção neuromuscular (JNM) pode ser usada para estudar as características conservadas de lançamento glutamatérgico. Desde Jan e de Jan estudo1, as terceiro ínstar larvas tem sido amplamente costumava estudar evocado e espontânea transmissão sináptica monitorando potenciais de junção excitatória (EJPs) ou correntes (EJCs). EJPs são comumente registrados intracelular com um microeléctrodo de vidro afiado, e refletem a atividade do MNJ inteira, incluindo todos os boutons fazendo sinapses para a fibra muscular determinada.
Em contraste, a atividade de um número limitado dos sítios de lançamento pode ser gravada focally posicionando uma dica micropipeta perto de terminais neuronais ou varicosidades sinápticas. Esta técnica foi originalmente empregada por Katz e Miledi2, e gravações extracelulares focais têm sido empregadas com sucesso em várias preparações de JNM, incluindo sapo3,4,5, rato6 , 7 , 8, crustáceo,9,10,11,12,13,14,15,16e Drosófila17,18,19,20,21,22,23. Esta abordagem foi desenvolvida por Dudel, quem otimizado macropatch recodificação eletrodos24,25. Na implementação do Dudel, esta técnica estreitamente alinhados a solta-remendo-braçadeira método26.
O MNJ larvas de Drosophila definiu claramente boutons sinápticas e linhas transgénicas com geneticamente codificadas etiquetas fluorescentes neuronais (ver Tabela de materiais) estão prontamente disponíveis. Estas vantagens nos permitiram gravar EJCs e mEJCs de um selecionado bouton sináptica20,21,22. Aqui, descrevemos esta técnica em detalhe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosófila representa um organismo modelo vantajoso para estudar a transmissão sináptica. Várias configurações de gravação foram usadas no MNJ larval, incluindo gravações intracelulares de potenciais sinápticos, gravações das correntes sinápticas com dois eletrodos tensão braçadeira33,34e macropatch focal gravações das correntes sinápticas descritas aqui. A última técnica permite a quantificação precisa da transmissão sináptica em…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Com a subvenção de NIH R01 MH 099557
Materials
| Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
| Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
| Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
| Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
| TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
| TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
| Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
| Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
| Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
| Quantan | In-house software | – | Software for signal processing |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
| cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | – | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |
Referências
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