Fraccionamento subcelular para activação de ERK tratamento de peptídeo derivado mitocondrial

Summary

Este protocolo descreve como estimulam as células com peptídeos derivados mitocondriais e avaliar a cascata de sinalização e localização de fosfo-proteínas.

Abstract

Peptídeos derivados mitocondrial (MDPs) são uma nova classe de peptídeos que são codificados por frames de leitura abertos pequenos dentro de outros genes conhecidos do genoma mitocondrial. MDPs têm uma grande variedade de efeitos biológicos como protegendo os neurônios da apoptose, melhorando marcadores metabólicos e protegendo as células da quimioterapia. Humanin foi o MDP primeiro a ser descoberto e o peptídeo mais estudado entre a família MDP. Os receptores de membrana e vias de sinalização a jusante de humanin foram cuidadosamente caracterizadas. MDPs adicionais tais como MOTS-c e SHLP1-6 foram descobertos mais recentemente e os mecanismos de sinalização ainda precisa ser elucidado. Aqui nós descrevemos um método de cultura com base de célula para determinar a função destes peptides. Em particular, técnicas de fracionamento celular em combinação com mancha ocidental permitem a determinação quantitativa da ativação e translocação de importante molécula de sinalização. Embora existam outros métodos de fracionamento celular, o descrito aqui é um método fácil e simples. Estes métodos podem ser usados para elucidar ainda mais o mecanismo de ação desses peptídeos e outros agentes terapêuticos.

Introduction

Estudos emergentes mostram que peptídeos derivados mitocondriais (MDPs) desempenham importantes funções no metabolismo e cytoprotection^1,2,3. Compreensão da via de transdução de sinal na presença de MDPs nos dá insight sobre o mecanismo pelo qual o MDPs modular várias funções. O primeiro PDM identificado, humanin, foi mostrado para aumentar a quinase de sinal-regulado extracellular 1/2 (ERK1/2) fosforilação através de seu receptor ligação^4,5. No entanto, o efeito a jusante de ERK1/2 ativação é ainda underexplored.

....

Protocol

1. tratamento de peptídeos às células

1. placa 2 milhões SH-SY5Y ou células HEK293 (2 x 10 ⁶) em um 10 cm do prato e cultivá-las por 2 dias
2. (opcional) no outro dia, lave as células com Dulbecco isento de soro ' s modificada Águia mídia médio (DMEM) uma vez e incubar com soro DMEM livre durante a noite, se o tratamento deve ser feito em meios livres de soro.
3. No dia 3, dissolver peptídeos de S14G-humanin em 0,2 µm filtrado, água destilada e reconstituí-los como solução estoque de 1mM.
   Nota: Os peptídeos devem ser dissolvidos em solvente apropriado, que pode ser determinado pelas características sequência do peptide (p....

Results

Usando o procedimento apresentado aqui, tratamos de células HEK293 e SH-SY5Y com 1 μM e 100 μM S14G-humanin, um potente humanin analógico²¹, respectivamente, em completa mídia para os períodos de tempo indicado (Figura 1A e Figura 1 B). em seguida examinamos a forma fosforilada e total de ERK1/2 em Thr²⁰²/Tyr²⁰⁴ de extratos de proteínas totais. S14G-.......

Discussion

Aqui, temos demonstrado que humanin mediada por peptídeo ERK1/2 ativação ocorre em dois diferentes tipos de células, e a Localização subcellular de ERK1/2 registrados pode ser diferente dependendo das condições (por exemplo, dose de peptídeo, ponto do tempo e célula tipo). Tem sido demonstrado que humanin sinais através de dois receptores diferentes^22,23, que pode explicar as diferenças na sinalização entre as linhas de duas células, bem como a exigência.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
p44/42 MAPK (ERK1/2)	Sinalização celular	9102	Diluição 1:1.000
fosfo-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204)	Sinalização celular	4370	Diluição 1:1.000
Lamina B1	Sinalização celular	12586	Marcador nuclear, diluição 1:1.000
GAPDH	sinalização celular	5174	Marcador citoplasmático, diluição 1:2.000
Tom20	Santa cruz	SC-17764	Marcador mitocondrial, Diluição 1:2.000
anti-Rabbit-HRP conjugado	Sinalização celular	7074	Diluição 1:30.000
RIPA Lise e Tampão de Extração	ThermoFisher SCIENTIFIC	89900
100 mm Placa de Cultura	ThermoFisher SCIENTIFIC	12556002
HNG peptídeo	Genescript
25mm filtro de silagem	ThermoFisher SCIENTIFIC	09-719A
HEPES	Sigma	H3375
MgCl2	Sigma	M8266
KCl	Sigma	P9333
Glicerol	Sigma	G9012
Triton X-100	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP151-100
EDTA	Sigma	3609
MOPS	Sigma	M1254
EGTA	Sigma	E3889
Sacarose	Sigma	S7903
Tris-base	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP152-1
HCL	Sigma	H1758
PBS	Lonza	17-512F
Raspador de Células	FALCON	353085
Halt™ Coquetel de Inibidor de Protease e Fosfatase (100X)	ThermoFisher SCIENTIFIC	78440
Thomas Pilão Moedor de Tecido Conjuntos com Pilões Lisos	Thomas Scientific	3432S90
Tween-20	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP337-500
BSA	ThermoFisher SCIENTIFIC	BP1600-100
8-16% Mini-PROTEAN TGX Géis	de Proteína Pré-moldadosBIO RAD	4561104
Mini Módulo Trans-Blot	BIO RAD	1658030
Sistema de Transferência Turbo Trans-Blot	BIO RAD	1704150
Trans-Blot Turbo RTA Mini Kit de Transferência PVDF	BIO RAD	1704272
Substratos de Blotting Western ECL	BIO RAD	1705060
Restaurar Tampão	de Decapagem Western blotThermoFisher SCIENTIFIC	21059
Dulbecco's Modified Eagle Medium	ThermoFisher SCIENTIFIC	11965-092
Sonicator, Medel: FB120	ThermoFisher SCIENTIFIC	695320-07-12