लाइव सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी माइक्रोबियल सेल विकास के दौरान आवश्यक प्रक्रियाओं का पालन करने के लिए
Summary
बैक्टीरिया में आवश्यक प्रक्रियाओं के समारोह को समझना चुनौतीपूर्ण है । लक्ष्य विशेष रंजक के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी माइक्रोबियल सेल विकास और कोशिका चक्र प्रगति में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । यहां, एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens को आवश्यक प्रक्रियाओं के लक्षण वर्णन के लिए लाइव सेल इमेजिंग के लिए विधियों को हाइलाइट करने के लिए जीवाणु मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है ।
Abstract
इस तरह के डीएनए प्रतिकृति और अलगाव के रूप में कोर सेलुलर प्रक्रियाओं, प्रोटीन संश्लेषण, सेल दीवार के संश्लेषण, और कोशिका विभाजन जीवाणुओं के अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं जो प्रोटीन के समारोह पर भरोसा करते हैं । इन प्रक्रियाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए लक्ष्य-विशिष्ट रंगों की श्रृंखला को जांच के रूप में उपयोग किया जा सकता है । lipophilic रंगों के साथ धुंधला झिल्ली संरचना, लिपिड microdomains के दृश्य, और झिल्ली blebs का पता लगाने के अवलोकन में सक्षम बनाता है । फ्लोरोसेंट-डी-अमीनो एसिड (FDAAs) का उपयोग peptidoglycan के स्थलों की जांच करने के लिए, कोशिका दीवार की उत्पत्ति या कोशिका वृद्धि के स्वरूप में संभावित दोषों का संकेत कर सकते हैं । अंत में, न्यूक्लिक एसिड दाग डीएनए प्रतिकृति या गुणसूत्र अलगाव में संभावित दोषों का संकेत कर सकते हैं । Cyanine डीएनए दाग लेबल रहने वाली कोशिकाओं और समय के लिए उपयुक्त हैं-चूक सूक्ष्मता सेल विकास के दौरान nucleoid आकृति विज्ञान के वास्तविक समय टिप्पणियों को सक्षम करने के लिए. कोशिका लेबलिंग के लिए प्रोटोकॉल प्रोटीन कमी म्यूटेंट के लिए लागू किया जा सकता झिल्ली संरचना में दोषों की पहचान करने के लिए, कोशिका दीवार की उत्पत्ति, या गुणसूत्र अलगाव । इसके अलावा, समय चूक माइक्रोस्कोपी एक आवश्यक प्रोटीन के रूप में रूपात्मक परिवर्तन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है हटा दिया और प्रोटीन समारोह में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, आवश्यक कोशिका विभाजन प्रोटीन की कमी रेशा या शाखाओं में परिणाम है, जबकि सेल वृद्धि प्रोटीन की कमी कोशिकाओं के कारण हो सकता है छोटे या राउंडर । यहां, सेल वृद्धि के लिए प्रोटोकॉल, लक्ष्य विशेष लेबलिंग, और समय चूक माइक्रोस्कोपी जीवाणु संयंत्र रोगज़नक़ एग्रोबेक्टीरियम tumefaciensके लिए प्रदान की जाती हैं । एक साथ, लक्ष्य विशिष्ट रंजक और समय चूक माइक्रोस्कोपी ए. tumefaciens में आवश्यक प्रक्रियाओं के लक्षण वर्णन सक्षम करें । अंत में, उपलब्ध कराए गए प्रोटोकॉल आसानी से अंय बैक्टीरिया में आवश्यक प्रक्रियाओं की जांच संशोधित किया जा सकता है ।
Introduction
बैक्टीरियल कोशिका चक्र के माध्यम से प्रगति झिल्ली और कोशिका दीवार के संश्लेषण, डीएनए प्रतिकृति और अलगाव, और कोशिका विभाजन सहित कई प्रक्रियाओं के समन्वय की आवश्यकता है. बैक्टीरियल कोशिका जीवविज्ञान की जटिलता को पूरी तरह समझने के लिए, इन आवश्यक घटनाओं का अध्ययन करना आवश्यक है; हालांकि, यह एक गैर तुच्छ काम के बाद से सेल व्यवहार्यता समझौता है जब इन रास्ते के प्रमुख घटक mutagenized हैं । Epifluorescence माइक्रोस्कोपी लक्ष्य के साथ युग्मित विशिष्ट रंजक wildtype और उत्परिवर्ती बैक्टीरियल उपभेदों में इन आवश्यक प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है ।
Peptidoglycan-विशिष्ट रंजक फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक्स शामिल (vancomycin-FL, bocillin-FL) और फ्लोरोसेंट-डी-अमीनो एसिड (उदाहरण के लिए, 7-hydroxycoumarin-3-carboxylic एसिड-3-अमीनो-डी-alanine, हाडा; 4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-7-nitrobenzofurazan-3-एमिनो-डी-alanine ̈नदा; tetramethylrhodamine-3-अमीनो-डी-alanine; टाडा). ग्राम में सकारात्मक बैक्टीरिया, फ्लोरोसेंट एंटीबायोटिक सादृश्य के उपघातक सांद्रता के उपयोग peptidoglycan के साइटों की जांच करने के लिए एक प्रभावी रणनीति peptidoglycan प्रविष्टि पैटर्न1,2प्रकट करने के लिए किया गया है, 3,4. जबकि फ्लोरोसेंट vancomycin लेबलिंग निश्चित ग्राम में peptidoglycan प्रविष्टि पैटर्न में अंतर्दृष्टि लाभ के लिए इस्तेमाल किया गया है नकारात्मक जीवाणु5, बाहरी झिल्ली आम तौर पर एक पारगम्यता बाधा है कि फ्लोरोसेंट के उपयोग को रोकता है प्रदान करता है जीवित कोशिकाओं में peptidoglycan के लिए एक जांच के रूप में एंटीबायोटिक दवाओं । इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट के लघु दालों-डी-अमीनो एसिड या डी-एमिनो एसिड biorthogonal कार्यात्मक समूहों के साथ covalently हाल ही में peptidoglycan प्रविष्टि के लेबल क्षेत्रों बैक्टीरियल कोशिकाओं6,7के रहने की एक विस्तृत श्रृंखला में । peptidoglycan प्रविष्टि है कि सिंथेटिक डी अमीनो एसिड के साथ मनाया गया है के पैटर्न कबरा और septal (ई कोलाई और बैसिलस सबटिलिस), ध्रुवीय और septal (एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens और लिस्टिरिया monocytogenes), septal केवल (Staphylococcus स्ताफ्य्लोकोच्चुस), और शिखर (Streptomyces वेनेजुएला)6,7. इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि बैक्टीरिया सेल दीवार के विविध पैटर्न का प्रदर्शन उत्पत्ति और है कि सिंथेटिक डी के उपयोग के रूप में विकास पैटर्न की जांच के लिए एमिनो एसिड की जांच कई बैक्टीरिया में एक मूल्यवान रणनीति है ।
रंग है कि जीवाणु गुणसूत्रों लेबल deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) विशिष्ट माइनर नाली बांधने की मशीन (4, 6-diamidino-2-phenylindole शामिल हैं; DAPI) और उच्च अपनत्व cyanine रंजक (हरा और नारंगी; सामग्री सूची देखें). DAPI स्थिर कोशिकाओं के दाग पर्यावरण के नमूनों से बैक्टीरिया की गणना में सहायता करता है8, जबकि जीवित कोशिकाओं के DAPI धुंधला जीवाणु व्यवहार्यता9संकेत करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इसके विपरीत, नारंगी और हरे रंग के रूप में cyanine रंजक अक्सर झिल्ली impermeant “मृत” सेल दाग के रूप में वर्णित गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं को9गणना कर रहे हैं । उल्लेखनीय है, जब इन एजेंटों कोशिका वृद्धि के दौरान बैक्टीरियल nucleoid की आकृति विज्ञान जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, DAPI, नारंगी, और हरे सभी झिल्ली permeant और जीवित कोशिकाओं लेबलिंग के लिए सक्षम होना दिखाया गया10। लाइव ई. कोलाई कोशिकाओं में, डीएनए के DAPI धुंधला कोशिका और पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश perturbs nucleoid संरचना करने के लिए DAPI-सना हुआ कोशिकाओं के दोहराया जोखिम से ऑटो प्रतिदीप्ति के कारण फैलाना प्रतीत होता है10। नारंगी के साथ ई. कोलाई या बी सबटिलिस धुंधला पता चलता है कि इस डाई झिल्ली permeant है और सेल विकास, डीएनए प्रतिकृति, या गुणसूत्र अलगाव प्रभाव के बिना जीवित कोशिकाओं में डीएनए के लिए बाध्यकारी पर लंबे समय तक चलने प्रतिदीप्ति प्रदान करता है10 . इन टिप्पणियों का सुझाव है कि cyanine डीएनए रंजक कई बैक्टीरिया में कोशिका वृद्धि के दौरान nucleoids की आकृति विज्ञान की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
फॉस्फोलिपिड-विशिष्ट stryl रंजक जैसे N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) फिनाइल) hexatrienyl) pyridinium dibromide (4-64; सामग्री सूची देखें) cationic यौगिकों और नकारात्मक शुल्क के साथ तरजीही रूप से संबद्ध हैं फॉस्फोलिपिड जैसे cardiolipin और phosphatidylglycerol11। अलग पैटर्न मनाया जब 4-64 विभिंन बैक्टीरिया की झिल्ली लेबल के लिए प्रयोग किया जाता है । ई कोलाईमें, 4-64 डंडे में समृद्ध है, पार्श्व दीवार के साथ बैंड में, और देर से पूर्व के विभाजन साइटों में प्रभागों कोशिकाओं12। बैसिलस सबटिलिसमें, 4-64 लेबलिंग में सक्षम बनाता है लिपिड13सर्पिल का दृश्य । एग्रोबेक्टीरियम tumefaciensमें, 4-64 बाहरी झिल्ली लेबल और एक विशेषता “घोड़े की नाल” पैटर्न जिसमें वृद्धि पोल लेबलिंग से रहित है में मनाया जाता है14,15। इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि ये जीवाणु लिपिड डोमेन जो सेलुलर विषमता में योगदान की उपस्थिति के कारण विषम लिपिड वितरण प्रदर्शन । इस तरह के प्रसार लेबलिंग की उपस्थिति के रूप में 4-64 लेबलिंग पैटर्न में परिवर्तन, blebs या बुलबुले, invaginations, या झिल्ली संकोचन निस्र्पक म्यूटेंट में जानकारीपूर्ण जा सकता है कि प्रभाव के वितरण या लिपिड के संश्लेषण ।
धुंधला कोशिकाओं से परे, प्रोटीन आवश्यक प्रक्रियाओं में भाग लेने के समारोह का निर्धारण करना आवश्यक है । आवश्यक प्रोटीन का लक्षण वर्णन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह आवश्यक जीन को नष्ट करने और phenotypic परिणामों का अध्ययन करने के लिए संभव नहीं है । इस प्रकार, वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि प्रोटीन गिरेगा उभरा है । उदाहरण के लिए, एक आवश्यक जीन अपने देशी प्रमोटर के बजाय एक inducible प्रमोटर के नियंत्रण में रखा जा सकता है । Inducible प्रवर्तकों जैसे छोटे अणुओं के लिए उत्तरदायी होते हैं; जिंक16, isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)17,18,19,20,21, arabinose22, vanillate17,23, और xylose23, इस प्रकार लक्ष्य जीन की प्रतिलिपि रहता है और ब्याज की प्रोटीन जब उत्प्रेरण निकाल दिया है समाप्त हो गया है । ब्याज की कमी आवश्यक प्रोटीन के लिए वैकल्पिक दृष्टिकोण सिंथेटिक riboswitches24 जो छोटे अणु-आरएनए बातचीत का उपयोग करने के लिए लक्ष्य जीन की प्रतिलिपि बाधा, CRISPR हस्तक्षेप25,26 लक्ष्य जीन के प्रतिलेखन ब्लॉक करने के लिए, और inducible प्रोटीन गिरावट27,28 जो पेप्टाइड टैग का उपयोग करता है ClpXP द्वारा क्षरण के लिए प्रोटीन लक्ष्य को छेड़ो । कमी उपभेदों के लक्षण वर्णन के लिए केवल एक कम समय कोशिकाओं व्यवहार्यता खो देते हैं, इसलिए, प्रोटीन की कमी के दौरान समय पर कोशिकाओं की सूक्ष्म इमेजिंग लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है । दरअसल, बैक्टीरियल कोशिकाओं के रहने वाले माइक्रोस्कोपी मौलिक जैविक प्रक्रियाओं में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए सक्षम है, सेल आकार रखरखाव, स्राव, और compartmentalization29के तंत्र सहित ।
a. tumefaciens एक जीवाणु संयंत्र रोगज़नक़ है30 और प्राकृतिक आनुवंशिक इंजीनियर31,३२। इस प्रकार, pathogenicity से संबंधित तंत्र, जिसमें मेज़बान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन३३,३४,३५, स्राव३६, और होस्ट परिवर्तन30,31, ३७ बड़े पैमाने पर जांच की गई है । रणनीति है कि ए. tumefaciens मध्यस्थता रोग को रोकने या संयंत्र परिवर्तन को बढ़ाने के डिजाइन करने के लिए, ए. tumefaciens अस्तित्व के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं को बेहतर समझने की जरूरत है । लक्ष्य विशिष्ट रंजक और ए. tumefaciens18 के लिए एक प्रोटीन कमी रणनीति के हाल के विकास के उपयोग के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए एक साधन प्रदान करता है ।
यहां, wildtype के सूक्ष्म विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल, उत्परिवर्ती, और प्रोटीन की कमी के उपभेदों के ए. tumefaciens प्रदान की जाती हैं । पहले दो प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे कोशिकाओं को तैयार करने के लिए और उंहें लक्ष्य विशिष्ट रंगों के साथ लेबल । तीसरा प्रोटोकॉल agarose पैड (चित्रा 1) और इमेजिंग बैक्टीरियल कोशिकाओं (चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4) तैयार करने के लिए कदम दर कदम निर्देश प्रदान करता है. इन प्रोटोकॉल भी अतिरिक्त अनुकूलन के साथ अंय बैक्टीरिया के लिए अलग मीडिया की स्थिति, विकास दर, ऑक्सीजन आवश्यकताओं, और सेल संरचनाओं के लिए खाते के लिए उपयुक्त हो सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल में ए. tumefaciens wildtype, उत्परिवर्ती, और कमी उपभेदों की जांच के लिए प्रक्रियाओं की एक श्रृंखला है । यह ध्यान देने योग्य है कि प्रोटोकॉल अनुभाग में सूचीबद्ध प्रक्रियाओं के सभी आसानी से अतिरिक्त स…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम चित्रा 2 और चित्रा 4में इस्तेमाल FDAAs के उपहार के लिए माइकल VanNieuwenhze (इंडियाना विश्वविद्यालय) का शुक्र है । हम इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान प्रतिक्रिया के लिए ब्राउन लैब के सदस्यों को धंयवाद । ए. tumefaciens सेल वृद्धि और विभाजन पर ब्राउन लैब में अनुसंधान राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (IOS1557806) द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Bacterial Strains | |||
| Agrobacterium tumefaciens C58 | ATCC | 33970 | Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264. |
| Agrobacterium tumefaciens C58ΔtetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA ΔctrA | Figueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. Mini-Tn7 insertion in an artificial attTn7 site enables depeltion of the essentail master regulator CtrA in the phytopathogen Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Components | |||
| ATGN Minimal Medium | To 1 L of sterilized water add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. For plates, add 15 g Bacto Agar to 1 L of water and autoclave. Cool to 55 °C and add 50 ml 20X Buffer, 50 ml 20X Salts, 12.5 ml 40% glucose. | ||
| 20X AT Buffer | Add 214 g/L KH2PO4 to water and adjust pH to 7.0 with sodium hydroxide. Autoclave. | ||
| NaOH | Fisher BioReagents | BP359 | |
| KH2PO4 | Fisher Chemical | P288 | |
| 20X AT Salts | Add 40 g/L (NH4)2SO4, 3.2 g/L MgSO4•7H2O, 0.2 g/L CaCl2•2H2O, and 0.024 g/L MnSO4•H2O to water. Autoclave. | ||
| (NH4)2SO4 | Fisher Chemical | A701 | |
| MgSO4•7H2O | Fisher BioReagents | BP213 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher BioReagents | BP510 | |
| MnSO4•H2O | Fisher Chemical | M114 | |
| Glucose | Fisher Chemical | D16 | Prepare 40% stock in water. Filter sterilize. |
| Bacto Agar | Fisher BioReagents | BP1423 | Add 15 g to 1 L of water when preparing plates. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optional Media Additives | |||
| Kanamycin | GoldBio | K-120 | Prepare as a 100 mg/ml stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 200 µg/ml. |
| IPTG | GoldBio | I2481C5 | Prepare as a 1 M stock solution in water and filter sterilize. Use at final concentration of 1 mM as needed for induction. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscopy Materials | |||
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550D | 25 X 75 X 1.0 mm. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Microscope Cover Glass | Fisherbrand | 12-541-B | 22 X 22 mm. No. 1.5. Clean with Sparkle glass cleaner. |
| Sparkle Glass Cleaner | Home Depot | 203261385 | Ammonia and alcohol free. |
| Ultra Pure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | Add to water, PBS, or media to a final concentration of 1 – 1.5%. Melt in microwave and place on 70 C |
| PBS | Fisher BioReagents | BP399500 | 10X solution to be diluted to 1X with sterile water. |
| Parafilm | Bemis | PM-999 | Laboratory film used as gasket in agarose pad preparation. |
| VALAP | Add equal weights of lanolin, parafin wax, and petroleum jelly to a conical tube. Heat tube in 70 °C dry, bead or water bath to melt and mix. Apply VALAP while still molten. | ||
| Lanolin Butter | SAAQIN | SQ-LAB-R1 | |
| Petroleum Jelly | Target Corp. | 06-17644 | |
| Paraffin Wax | Crafty Candles | 263012 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Target-specific dyes | |||
| DMSO | Fisher BioReagents | BP231-1 | Use to dilute stock solutions of dyes as needed. |
| FDAAs (NADA, HADA,TADA) | FDAAs can be synthesized or acquired through agreement with Mike VanNieuwenhze (Indiana University). Prepare 100 mM stock solution in DMSO. Use at a final concentration of 5 mM. | ||
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62247 | Prepare 1 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 1 µg/ml. |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S11368 | Stock concentration is 5 mM in DMSO. Use at final concentration of 5 µM. |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Prepare 8 mg/ml stock solution in DMSO. Use at final concentration of 8 µg/ml. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dry bath | Sheldon Manufacturing, Inc. | 52120-200 | |
| Metallic thermal beads | Lab Armor | 42370-002 | |
| Epifluorescence microscope equipped with an EMCDD camera | Nikon Eclipse TiE equipped with a QImaging Rolera em-c2 1K electron-multiplying charge-coupled-device (EMCCD) camera is used in this work. |
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