أجهزة ميكروستروكتوريد Microinjection الأمثل وتصوير يرقات الزرد
Summary
Microinjection اليرقات والأجنة الزرد أسلوب حاسم ولكنها صعبة المستخدمة في نماذج الزرد كثيرة. نقدم هنا، مجموعة من الأدوات عبارة للمساعدة في تحقيق الاستقرار والتوجه الزرد microinjection والتصوير.
Abstract
وظهرت الزرد كنموذج قوي من مختلف الأمراض التي تصيب الإنسان وأداة مفيدة لمجموعة متزايدة من الدراسات التجريبية، التي تغطي الأساسية علم الأحياء التنموي من خلال شاشات الجينية والكيميائية على نطاق واسع. ومع ذلك، العديد من التجارب، لا سيما تلك المتعلقة بالعدوى ونماذج إكسينوجرافت، وتعتمد على microinjection وتصوير الأجنة واليرقات، وهي تقنيات الشاقة التي تتطلب مهارة وخبرة. لتحسين الدقة والإنتاجية الحالية microinjection التقنيات، قمنا بتطوير سلسلة من الأجهزة ميكروستروكتوريد لتوجيه واستقرار الأجنة الزرد في 2 يوما بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) في اتجاه البطني أو الظهرية الجانبية قبل الإجراء. للمساعدة في تصوير الأجنة، صممنا أيضا جهاز بسيط مع القنوات التي توجه الزرد 4 أفقياً جنبا إلى جنب ضد زلة غطاء زجاج. معا، والأدوات التي نحن الحاضرين هنا تبين فعالية النهج فوتوليثوغرفيك لإنشاء الأجهزة مفيدة لتعظيم الاستفادة تقنيات الزرد.
Introduction
الزرد ظهرت كنموذج قوي للعديد من المجالات، من الدراسات الأساسية البيولوجيا التنموية على نطاق واسع الوراثية والكيميائية شاشات1،2. التلاعبات الجينية الروتينية، مثل ترانسجينيسيس والطفرات كريسبر/Cas9، overexpression الجينات وضربه قاضية تعتمد على microinjection المواد الوراثية في اقحه خلية واحدة، مما أدى إلى وضع بسيطة وسهلة الاستخدام، تجارياً الأدوات المتاحة لتوجيه واستقرار البيض لحقن3. الطرق الأخرى، مثل زرع الأعضاء، والعدوى، غالباً ما تتطلب microinjection في وقت لاحق مرحلة الأجنة واليرقات باستخدام الإبر الشعرية قياس أكبر4. ومع ذلك، استخدام إبر قياس أكبر تحديات كبيرة التقنية، كما أنها أكثر صعوبة لاختراق الأنسجة المستهدفة دون دفع أو المتداول الجنين. في ظل هذه الظروف، قد لا يكون الحصول على التوتر المياه المناسبة المطلوبة لتثبيت الجنين في حين يصعب تفادي التجفيف أثناء الإجراء، والأجنة المنحى المثالي لحقن الأنسجة المستهدفة.
بعد microinjection، يكون من المفيد غالباً الشاشة حقن الأجنة لتحديد تلك التي قد تم حقنه بنجاح، والتقاط الصور للمرة الأولى النقطة. لمواجهة هذه التحديات، قمنا بتطوير مجموعة من الأجهزة ميكروستروكتوريد التي تساعد على استقرار 2 من الأجنة إدارة الشرطة الاتحادية في التوجهات المختلفة سواء microinjection5، وللفرز السريع القائم على الصورة بعد الحقن.
للحصول على قرار الهيكلية الكافية في هذه الأجهزة، ونحن تستخدم تقنيات فوتوليثوغرفيك. يشيع استخدامها في الصناعات الإلكترونية الدقيقة وأكثر مؤخرا باستقراء لتلفيق موائع جزيئية، يمكن تحقيق هذه النهج الهياكل العمودية تتراوح بين 1-1,000 ميكرون، نطاق مناسب تماما للتلاعب بالأجنة الزرد واليرقات. كانت ملفقة كافة الأجهزة باستخدام بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، ورخيصة وقوية جسديا وبيولوجيا الخاملة وشفافة.
ميكروستروكتوريد صفائف السطحية (MSAs) تم تنسيقها ككتل PDMS مع سطح العلوي منقوشة، مماثلة لقنوات بسيطة في كتل [اغروس] شائع الاستخدام microinjection البيض. لفحص ما بعد الحقن، يمكن صفت 6 أجهزة تصوير في لوحة 6-جيدا زجاجية قياسية. صممت هذه الأجهزة لتحميل سهل للأجنة، بينما مريح يسمح الإجراء تفريغ إنقاذ الأجنة محددة، تيسير المستندة إلى الصور فحص النهج بطريقة أكثر سهولة من تلك الأجهزة وضعت سابقا مختبر بيب6.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يمكننا وصف الاستخدام الأجهزة وضعنا مؤخرا تيسير إدارة الشرطة الاتحادية 2 الزرد microinjection5، وإدخال جهاز بسيط تركيب مجاناً [اغروس] لتصوير مريحة للأجنة. وتبرز هذه الأدوات الأداة المساعدة فوتوليثوغرفيك تقنيات تصنيع الأجهزة مفيدة لتقنيات الزرد.
أننا وجدنا الأجه?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يود أن يشكر لانجينو ديفيد لسخاء توفير مساحة الحوض؛ إريك ستون، جون مور جيم وتشين تانغ للمساعدة في صيانة الزرد والكواشف، وروبرتسون أن واليوت Hagedorn من مختبر ليونارد زون لشراء سلالة الزرد المستخدمة هنا. كما أنها يود أن يشكر هورتادو أوكتافيو لتقديم المشورة بشأن التقنيات فوتوليثوغرفيك. مولت FE زمالات من مستشفى شرينير للأطفال و “الرابطة الأسترالية الأمريكية”. تم تمويل هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة منح GM92804.
Materials
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI – 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
Referências
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
- Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
- Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
- Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
- Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
- Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
- Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).
- Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).
- Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
- Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
- Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).
