Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish
Summary
Microiniezione di zebrafish embrioni e le larve è una tecnica fondamentale ma impegnativa usata in molti modelli di zebrafish. Qui, presentiamo una gamma di strumenti di Microscala per aiutare nella stabilizzazione e orientamento di zebrafish per microiniezione e di imaging.
Abstract
Zebrafish sono emerso come un potente modello di varie malattie umane e uno strumento utile per una gamma crescente di studi sperimentali, che abbracciano fondamentale biologia inerente allo sviluppo attraverso agli schermi di genetici e chimici su larga scala. Tuttavia, molti esperimenti, soprattutto quelli legati alla infezione e modelli dello xenotrapianto, si basano su microiniezione e l’imaging di embrioni e le larve, che sono laboriose tecniche che richiedono abilità e competenze. Per migliorare la precisione e la velocità di trasmissione di corrente microiniezione, abbiamo sviluppato una serie di dispositivi microstrutturati per orientare e stabilizzare gli embrioni di zebrafish 2 giorni post fertilizzazione (dpf) nell’orientamento ventrale, dorsale o laterale prima dei procedura. Per facilitare l’imaging di embrioni, abbiamo anche disegnato un semplice dispositivo con canali che orientano 4 zebrafish lateralmente in parallelo contro un vetro vetrino coprioggetti. Insieme, gli strumenti che vi presentiamo qui dimostrano l’efficacia di approcci fotolitografica per generare dispositivi utili per l’ottimizzazione delle tecniche di zebrafish.
Introduction
Zebrafish sono emerse come un potente modello per molti campi, dagli studi di biologia dello sviluppo fondamentale a larga scala genetica e chimica schermi1,2. Sistematiche manipolazioni genetiche, come la sovraespressione genica, atterramento, CRISPR/Cas9 mutagenesi e transgenesi si basano su microiniezione di materiale genetico in singola cellula zigote, che ha portato allo sviluppo di semplice, facile da usare, nel commercio strumenti disponibili per orientare e stabilizzare le uova per iniezione3. Altri approcci, come il trapianto e l’infezione, spesso richiedono microiniezione in embrioni in fase successivi e larve utilizzando più grande calibro capillare aghi4. Tuttavia, uso di aghi di calibro più grandi presenta significative sfide tecniche, come è più difficile penetrare il tessuto dell’obiettivo senza spingere o l’embrione di rotolamento. In queste condizioni, ottenendo la tensione adatta dell’acqua necessaria per stabilizzare l’embrione, mentre è difficile evitare essiccazione durante la procedura e gli embrioni non può non essere idealmente orientato per l’iniezione nel tessuto bersaglio.
A seguito di microiniezione, è spesso utile paravento embrioni iniettati per selezionare quelli che sono stati iniettati con successo e per catturare le immagini del punto di tempo iniziale. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato una gamma di dispositivi microstrutturati che aiutano a stabilizzare 2 dpf embrioni in vari orientamenti microiniezione5sia per post-iniezione screening rapido basato sulle immagini.
Per ottenere una risoluzione sufficiente strutturale in questi dispositivi, abbiamo utilizzato le tecniche fotolitografiche. Comunemente impiegati nell’industria microelettronica e più recentemente estrapolato a microfluidic fabrication, questi approcci possono realizzare strutture verticali che vanno da 1-1.000 µm, una scala adatta alla manipolazione di embrioni di zebrafish e larve. Tutti i dispositivi sono stati fabbricati con polidimetilsilossano (PDMS), che è a buon mercato, fisicamente robusto, biologicamente inerte e trasparente.
Matrici di superficie microstrutturate (MSAs) sono state formattate come blocchi di PDMS con una superficie superiore a motivi, analoga ai canali semplici in agarosio blocchi comunemente usati per il microinjection di uovo. Per post-iniezione screening, 6 dispositivi di imaging possono essere schierati in una piastra 6-pozzetti con fondo di vetro standard. Questi dispositivi sono progettati per un facile caricamento di embrioni, mentre la procedura di scarico permette comodamente di salvataggio degli embrioni specifici, facilitando basata su immagine approcci di screening in modo più user-friendly rispetto quei dispositivi precedentemente sviluppato dalla Beebe laboratorio6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo l’uso di dispositivi abbiamo recentemente sviluppato per facilitare 2 dpf zebrafish microiniezione5e introdurre un dispositivo semplice montaggio privo di agarosio per imaging conveniente degli embrioni. Questi strumenti evidenziano l’utilità delle tecniche fotolitografiche per la fabbricazione di dispositivi utili per le tecniche di zebrafish.
Abbiamo trovato questo dispositivi MSA particolarmente utile per l’iniezione di cellule o particelle incline …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare David Langenau per generosamente offrendo spazio acquario; Eric Stone, John e Qin Tang per aiutare con manutenzione di zebrafish e reagenti e Anne Robertson ed Elliott Hagedorn dal laboratorio di Leonard Zon per procurare il ceppo di zebrafish utilizzato qui. Vorrebbero anche grazie a Octavio Hurtado per consigli sulle tecniche fotolitografiche. FE è stato finanziato da borse di studio dal Hospital di Shriner per bambini e l’American Association australiana. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere GM92804.
Materials
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI – 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
Referências
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