最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス
Summary
Zebrafish の胚・仔魚のマイクロインジェクションは多くのゼブラフィッシュ モデルで重要だが、挑戦的な手口です。ここでは、安定化を支援するためにマイクロ ツールの範囲とインジェクションとイメージングのゼブラフィッシュの方向を提案します。
Abstract
ゼブラフィッシュは、大規模な遺伝的・化学的画面を通じて基本的な発生生物学にまたがるさまざまな疾患や実験的研究の増加の範囲のための便利なツールの強力なモデルとして浮上しています。しかし、多くの実験、特にこれらの感染症と異種移植モデルに関連はマイクロインジェクションや胚とスキルと専門知識を必要とする困難な技術である幼虫の画像に依存します。精度と現在のマイクロインジェクション技術のスループットを向上させるため前、腹側、背側、または横方向に向き、2 日間ポスト受精 (dpf) でゼブラフィッシュ胚を安定させる微細構造デバイスのシリーズを開発、プロシージャ。胚のイメージングを支援、またオリエントのガラス製カバー スリップに対して平行に横方向に 4 ゼブラフィッシュ チャンネル付きシンプルなデバイスを設計しました。一緒に、ここで紹介するツールは、ゼブラフィッシュ技術の最適化のための有用なデバイスを生成するフォトリソグラフィー アプローチの有効性を示しています。
Introduction
ゼブラフィッシュ遺伝子を大規模の根本的な発生生物学の研究から多くの分野で強力なモデルとして浮上しているし、化学スクリーン1,2。単一細胞の受精卵は、商業的、簡単・使いやすいの開発につながっているに遺伝物質のマイクロインジェクションに依存して遺伝子の過剰発現、ノックダウン、CRISPR/Cas9 変異、遺伝子導入などのルーチンの遺伝子操作定位と注入3卵の安定化に使用できるツール。移植と感染症などの他のアプローチは、後の段階の胚およびより大きいゲージ キャピラリー針4を使用して幼虫にマイクロインジェクションを必要があります。但しより大きいゲージの針を使用は、押すか、または胚を圧延することがなく標的組織に浸透するより困難だと重要な技術的な課題を示します。これらの条件の下でプロシージャの間に乾燥を避けることは難しい、胎児を安定させるために必要な適切な水分張力と胚を取得できない場合があります理想的な標的組織への注入を指向。
次の顕微注入、注入された胚初期時点の画像をキャプチャして選択する正常に挿入されていることを画面に便利です。これらの課題に対応するマイクロインジェクション5とイメージ ベースの迅速なスクリーニング後注入の両方のさまざまな方向に 2 の dpf 胚を安定させるのに役立ちます微細構造デバイスの範囲を開発しました。
これらのデバイスに十分な構造の解像度を得るためには、我々 は写真平版の技術を活用しました。よく最近マイクロ加工に外挿するマイクロ エレクトロニクス産業で使用される、これらのアプローチは 1 1,000 μ m、ゼブラフィッシュの胚・仔魚の操作に最適なスケールに至る垂直構造を実現できます。安く、物理的に堅牢な生物学的に不活性で透明なポリジメチルシロキサン (PDMS) を使用してすべてのデバイスを作製しました。
微細加工表面のアレイ (MSAs) PDMS のパターン表面でのブロックとしてフォーマットされた、卵マイクロインジェクションをアガロース ブロックで簡単なチャンネルに似ています一般的に使用します。投与後検診 6 イメージング デバイスに標準ガラス底 6 ウェル プレートに配置できます。これらのデバイスは、胚のイージーローディング向け、アンロード ・ プロシージャは、便利なイメージ ベースの促進、特定胚の救助を可能にする間これらのデバイスよりもより使いやすい方法でスクリーニングのアプローチで作られた、ビービ研究室6。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここに述べる使用デバイスの最近行った dpf ゼブラフィッシュ マイクロインジェクション52 を容易にし胚の便利な画像の単純な agarose フリー実装デバイスを導入します。これらのツールは、ゼブラフィッシュのテクニックの有用なデバイスの作製に写真平版の技術の有用性を強調表示します。
我々 MSA デバイス特に有用な発見した細胞や粒子の射出用マ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は気前よく水槽スペースを提供するためデビッド Langenau を感謝したいです。エリック ・ ストーン、ジョン c. ムーア、秦唐は、ここで使用されるゼブラフィッシュ系統を調達のレナード ・ ゾンのラボからエリオット懸アン ・ ロバートソンと試薬、ゼブラフィッシュ メンテナンスを支援します。彼らはまたオクタビオ ウルタドのフォトリソグラフィー技術に関するアドバイスをありがとうしたいと思います。FE は、子供とアメリカのオーストラリア連合の Shriner の病院からの奨学金で賄われていた。この仕事 NIH によって資金が供給された GM92804 を付与します。
Materials
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI – 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
Referências
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