Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish
Summary
Microinjeção de zebrafish embriões e larvas é uma técnica crucial mas desafiador, usada em muitos modelos de zebrafish. Aqui, apresentamos uma gama de ferramentas de microescala para auxiliar na estabilização e orientação do zebrafish para microinjeção e a imagem latente.
Abstract
Zebrafish emergiram como um poderoso modelo de várias doenças humanas e uma ferramenta útil para uma gama crescente de estudos experimentais, abrangendo fundamentais da biologia do desenvolvimento através de telas em grande escala de genéticas e químicas. No entanto, muitas experiências, especialmente aqueles relacionados à infecção e modelos de enxerto heterólogo, dependem de microinjeção e imagem latente de embriões e larvas, que são técnicas laboriosas que exigem habilidade e experiência. Para melhorar a precisão e a taxa de transferência de técnicas de microinjeção atuais, desenvolvemos uma série de dispositivos microstructured orientar e estabilizar o zebrafish embriões na fertilização de post 2 dias (dpf) em orientação lateral, ventral ou dorsal, antes do procedimento. Para ajudar à imagem de embriões, criamos um dispositivo simples com canais que orientar 4 zebrafish lateralmente em paralelo contra uma lamela de vidro. Juntos, as ferramentas que apresentamos aqui demonstram a eficácia das abordagens fotolitográfica para gerar dispositivos úteis para a otimização das técnicas de zebrafish.
Introduction
Zebrafish emergiram como um poderoso modelo para muitos campos, a partir de estudos de fundamental biologia do desenvolvimento de grande escala genética e química telas1,2. Rotina manipulações genéticas, tais como a superexpressão do gene, nocaute, CRISPR/Cas9 mutagênese e transgênese dependem de microinjeção de material genético para o zigoto unicelular, que levou ao desenvolvimento de simples, fácil de usar, comercialmente ferramentas disponíveis para orientar e estabilizar os ovos para injeção3. Outras abordagens, tais como transplante e infecção, muitas vezes exigem microinjection em posterior fase de embriões e larvas usando maior calibre capilar agulhas4. No entanto, a utilização de agulhas de calibre maiores apresenta desafios técnicos significativos, como é mais difícil de penetrar o tecido-alvo sem empurrar ou rolando o embrião. Nestas condições, obtendo a água adequada a tensão necessária para estabilizar o embrião enquanto evitando a secagem durante o procedimento é difícil e embriões não pode ser idealmente orientado para injeção no tecido-alvo.
Após microinjeção, é frequentemente útil para embriões injetados para selecionar aqueles que foram injetados com êxito e para capturar imagens do ponto inicial tempo de tela. Para enfrentar estes desafios, desenvolvemos uma gama de dispositivos microstructured que ajudam a estabilizar 2 embriões dpf em várias orientações para microinjeção5e para pós-injeção rápida triagem baseada em imagem.
Para obter uma resolução estrutural suficiente nestes dispositivos, utilizamos técnicas fotolitográfica. Comumente utilizado em indústrias de microeletrônicos e mais recentemente extrapolada para fabricação de microfluidic, essas abordagens podem alcançar estruturas verticais que variam de 1-1.000 µm, numa escala adequada para manipulação de zebrafish embriões e larvas. Todos os dispositivos foram fabricados usando polydimethylsiloxane (PDMS), que é mais barato, robusto fisicamente, biologicamente inerte e transparente.
Matrizes de superfície microstructured (MSAs) foram formatados como blocos de PDMS com uma superfície superior padronizada, análogo dos canais simples em blocos de agarose comumente usado para microinjeção de ovo. Para rastreio pós-injeção, 6 dispositivos de imagem podem ser dispostos em uma padrão com fundo de vidro 6 placa de. Estes dispositivos são projetados para facilitar o carregamento de embriões, enquanto o procedimento de descarga convenientemente permite resgate de embriões específicos, facilitando baseada em imagem abordagens de rastreio de uma forma mais amigável do que aqueles dispositivos anteriormente desenvolvido pela Beebe laboratório6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, descrevemos o uso de dispositivos recentemente desenvolvemos para facilitar 2 dpf zebrafish microinjeção5e introduzir um dispositivo de montagem simples de agarose-livre para a imagem latente conveniente de embriões. Estas ferramentas destacam-se o utilitário de fotolitográfica técnicas para a fabricação de dispositivos úteis para as técnicas de zebrafish.
Encontramos dispositivos MSA particularmente útil para a injeção de células ou partículas prop…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer a David Langenau generosamente oferecendo espaço aquário; Eric Stone, John C. Moore e Qin Tang para ajudarem com a manutenção de zebrafish e reagentes e Anne Robertson e Elliott Hagedorn do laboratório de Leonard Zon para adquirir a zebrafish as estirpes utilizadas aqui. Também gostariam de agradecer conselhos sobre técnicas fotolitográfica Octavio Hurtado. FE foi patrocinada por bolsas do Hospital do Shriner para crianças e a associação americana do australiano. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder GM92804.
Materials
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI – 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
Referências
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