Dispositivos microestructurados para microinyección optimizado y la proyección de imagen de larvas de pez cebra
Summary
Microinyección de embriones de pez cebra y larvas es una técnica difícil pero crucial en muchos modelos de pez cebra. Aquí, presentamos una gama de herramientas de microescala para ayudar en la estabilización y la orientación del pez cebra para la microinyección y la proyección de imagen.
Abstract
Pez cebra han emergido como un poderoso modelo de varias enfermedades humanas y una herramienta útil para una gama cada vez mayor de estudios experimentales, que abarca la biología del desarrollo fundamental a través de las pantallas genéticas y químicas a gran escala. Sin embargo, muchos experimentos, especialmente los relacionados con infección y modelos de xenoinjerto, dependen de la microinyección y la proyección de imagen de los embriones y larvas, que son técnicas laboriosas que requieren habilidades y conocimientos. Para mejorar la precisión y el rendimiento de las técnicas de microinyección actuales, hemos desarrollado una serie de dispositivos microestructuradas para orientar y estabilizar embriones de pez cebra en 2 días post fertilización (dpf) en posición ventral, dorsal o lateral antes del procedimiento. Para ayudar en la proyección de imagen de los embriones, también hemos diseñado un dispositivo simple con los canales que Oriente 4 pez cebra lateralmente en paralelo contra un cubreobjetos de vidrio. Juntos, las herramientas que presentamos aquí demuestran la efectividad de enfoques photolithographic generar dispositivos útiles para la optimización de las técnicas de pez cebra.
Introduction
Pez cebra se han convertido en un poderoso modelo para muchos campos, de los estudios de desarrollo biología fundamental a escala genética y química pantallas1,2. Rutina manipulaciones genéticas, como la sobreexpresión del gen, caída, CRISPR/Cas9 mutagénesis y transgénesis dependen de microinyección de material genético en el zigoto unicelular, que ha llevado al desarrollo de simple, fácil de usar, comercialmente herramientas disponibles para orientar y estabilizar huevos para inyección3. Otros enfoques, como el trasplante y la infección, a menudo requieren microinyección en la posterior etapa embriones y larvas con mayor calibre capilar agujas4. Sin embargo, el uso de agujas de calibre más grandes presenta importantes retos técnicos, ya que es más difícil penetrar el tejido sin empujar o rodando el embrión. En estas condiciones, obteniendo la tensión de agua apropiada requerida para estabilizar el embrión mientras que evitar durante el procedimiento de secado es difícil y embriones no sean idealmente orientado para la inyección en el tejido diana.
Tras la microinyección, es a menudo útil embriones inyectados para seleccionar aquellos que han sido inyectados con éxito y para capturar imágenes del momento inicial de la pantalla. Para enfrentar estos desafíos, hemos desarrollado una gama de dispositivos microestructuradas que ayudan a estabilizar 2 embriones de dpf en varias orientaciones para microinyección5y para después de la inyección rápida proyección basada en imágenes.
Para obtener suficiente resolución estructural en estos dispositivos, utilizamos técnicas photolithographic. Se utilizan en las industrias microelectrónicas y más recientemente extrapolarse para la fabricación de microfluidos, estos enfoques pueden alcanzar estructuras verticales que van desde 1-1.000 μm, con una escala adecuada para manipulación de larvas y embriones de pez cebra. Todos los dispositivos fueron fabricados con polidimetilsiloxano (PDMS), que es barato, robusto físicamente, biológicamente inerte y transparente.
Arreglos de superficie microestructuradas (MSAs) fueron el formato de bloques de PDMS con una superficie modelada, análogo a los canales simple en bloques de agarosa utilizadas para microinyección de huevos. Para la investigación después de la inyección, 6 dispositivos de imágenes puede ser vestida en una placa de 6 pozos con fondo de cristal estándar. Estos dispositivos están diseñados para facilitar la carga de los embriones, mientras que el procedimiento de descarga convenientemente permite rescate de embriones específicos, facilitando imágenes evaluación enfoques de una manera más fácil de utilizar que los dispositivos desarrollado previamente por el Beebe laboratorio6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos el uso de los dispositivos recientemente desarrollado para facilitar 2 PD pez cebra microinyección5e introducir un dispositivo de montaje libre de agarosa simple imagen conveniente de embriones. Estas herramientas destacan la utilidad de técnicas photolithographic para la fabricación de dispositivos útiles para técnicas de pez cebra.
Hemos encontrado dispositivos MSA particularmente útil para la inyección de células o partículas tienden a la …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a David Langenau por generosamente proporciona espacio de acuario; Eric Stone, John C. Moore y Qin Tang para ayudar a mantenimiento de pez cebra y reactivos y Anne Robertson y Elliott Hagedorn del laboratorio de Leonard Zon para procurar la variedad de pez cebra utilizada aquí. También le gustaría agradecer a Octavio Hurtado para asesoramiento sobre técnicas photolithographic. FE fue financiado por becas del Hospital de Shriner para los niños y la Asociación Americana de Australia. Este trabajo fue financiado por los NIH grant GM92804.
Materials
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI – 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
Referências
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