Microstructured enheter för optimerad Mikroskop och Imaging av zebrafisk larver
Summary
Mikroskop av zebrafisk embryon och yngel är en avgörande men utmanande teknik som används i många zebrafiskar modeller. Här presenterar vi en rad hur provtagningsutrustningen skall verktyg till stöd i stabiliseringen och orientering av zebrafisk för både Mikroskop och imaging.
Abstract
Zebrafisk har dykt upp som en kraftfull modell av olika mänskliga sjukdomar och ett användbart verktyg för ett ökande utbud av experimentella studier, som spänner över grundläggande utvecklingsbiologi genom att storskaliga genetiska och kemiska skärmar. Dock lita många experiment, särskilt de som rör infektion och xenograft-modeller, på Mikroskop och avbildning av embryon och yngel, som är mödosam tekniker som kräver skicklighet och sakkunskap. För att förbättra precisionen och genomströmning av nuvarande Mikroskop tekniker har vi utvecklat en serie microstructured enheter att orientera och stabilisera zebrafiskar embryon på 2 dagar efter befruktning (dpf) i ventrala, dorsal, eller lateral riktning före den förfarandet. För att underlätta bildtagning av embryon, har vi också utformat en enkel anordning med kanaler som orienterar 4 zebrafiskar sidled parallellt mot ett glas täckglas. Tillsammans, visar de verktyg som vi presenterar här effektiviteten av photolithographic metoder att generera användbar enheter för optimering av zebrafisk tekniker.
Introduction
Zebrafisk har tillkommit som en kraftfull modell för många områden, från studier av grundläggande utvecklingsbiologi till storskaliga genetiska och kemiska skärmar1,2. Rutinmässiga genetiska manipulationer, som genen överuttryck, överväldigande, CRISPR/Cas9 mutagenes och genmodifiering lita på Mikroskop av genetiskt material i encelliga zygoten, vilket har lett till utvecklingen av enkel, lätt att använda, kommersiellt tillgängliga verktyg för orientering och stabilisera ägg för injektion3. Andra metoder, såsom transplantation och infektion, kräver ofta Mikroskop i senare skede embryon och yngel med större spårvidd kapillär nålar4. Användning av större spårvidd nålar presenterar emellertid betydande tekniska utmaningar, eftersom det är svårare att tränga igenom målvävnaden utan driver eller rullande embryot. Under dessa förhållanden kanske att erhålla lämpligt vatten spänning krävs för att stabilisera embryot samtidigt undvika torkning under förfarandet är svårt, och embryon inte idealiskt orienterad för injektion i målvävnaden.
Efter Mikroskop är det ofta användbart att skärmen injicerade embryon att välja de som framgångsrikt har injicerats, och ta bilder av den första tidpunkten. För att möta dessa utmaningar, har vi utvecklat en rad microstructured enheter som hjälper till att stabilisera 2 dpf embryon i olika riktningar Mikroskop5, såväl för snabb image-baserad screening efter injektion.
För att erhålla tillräcklig strukturell upplösning i dessa enheter, utnyttjade vi photolithographic tekniker. Vanligen används i mikroelektroniska industrier och mer nyligen extrapoleras till mikroflödessystem fabrication, kan dessa synsätt uppnå vertikala strukturer som sträcker sig från 1-1000 µm, en skala som väl lämpade för manipulation av zebrafisk embryon och yngel. Alla enheter var fabricerade med hjälp av Polydimetylsiloxan (PDMS), vilket är billigt, fysiskt robust, biologiskt inert och transparent.
Microstructured yta matriser (MSAs) var formaterade som block av PDMS med en mönstrad topp yta, analogt med de enkla kanalerna i agaros block används vanligen för ägg Mikroskop. För efter injektion screening, kan 6 imaging-enheter vara klädd i ett glas botten 6-väl Kantbockade. Dessa enheter är konstruerade för enkel lastning av embryon, medan förfarandet för lossning kan bekvämt räddning av specifika embryon, underlätta image-baserad screening metoder på ett mer användarvänligt sätt än dessa enheter tidigare utvecklats av den Beebe laboratorium6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här, vi beskriver användningen av enheter vi nyligen utvecklat för att underlätta 2 dpf zebrafiskar Mikroskop5, och införa en enkel agaros-fri montering anordning för bekväm avbildning av embryon. Dessa verktyg belysa nyttan av photolithographic tekniker för tillverkning av enheter som är användbar för zebrafiskar tekniker.
Vi har hittat MSA enheter särskilt användbart för injektion av celler eller partiklar benägna att aggregation inom Mikroskop nålen, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka David Langenau för generöst ge akvarium utrymme; Eric Stone, John C. Moore och Qin Tang för hjälp med zebrafiskar underhåll och reagenser, och Anne Robertson och Elliott Hagedorn från Leonard Zon’s lab för att skaffa zebrafiskar stammen används här. De skulle också vilja tacka Octavio Hurtado för råd om photolithographic tekniker. FE finansierades av stipendier från Shriner’s Hospital för barn och amerikansk australiska Association. Detta arbete finansierades av NIH bevilja GM92804.
Materials
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI – 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
Referências
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
- Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
- Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
- Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
- Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
- Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
- Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).
- Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).
- Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
- Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
- Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).
