Microstructured cihazlar için en iyi duruma getirilmiş mikroenjeksiyon ve Zebra balığı larva görüntüleme
Summary
Zebra balığı embriyo ve larva mikroenjeksiyon birçok Zebra balığı modellerinde kullanılan çok önemli ama zorlu bir tekniktir. Burada, Zebra balığı mikroenjeksiyon ve görüntüleme için yönünü ve istikrar içinde yardım etmek için microscale araçlar bir dizi mevcut.
Abstract
Zebra balığı ortaya çıkmıştır geniş çeşitli insan hastalıkları ve deneysel çalışmalar, artan bir dizi için yararlı bir araç güçlü bir model olarak büyük ölçekli kimyasal ve genetik ekranlar aracılığıyla temel gelişim biyolojisi kapsayan. Ancak, birçok deney, özellikle enfeksiyon ve xenograft modelleri, ilgili mikroenjeksiyon ve görüntüleme embriyo ve beceri ve uzmanlık gerektiren zahmetli tekniklerdir larva güveniyor. Hassas ve geçerli mikroenjeksiyon teknikleri-den geçerek artırmak için biz bir dizi yönlendirmek ve 2 gün sonrası döllenme (dpf), Zebra balığı embriyolar dengelemek için microstructured aygıtları önce menfez, dorsal veya yanal yönde geliştirdi yordam. Embriyo görüntülemede yardım için de paralel bir cam kapak notu karşı yanal olarak 4 Zebra balığı şark kanalları ile basit bir aygıt tasarlanmış. Birlikte, burada mevcut araçları Zebra balığı teknikleri optimizasyonu için yararlı aygıt oluşturmak için photolithographic yaklaşımlar etkinliğini göstermektedir.
Introduction
Zebra balığı biyolojinin temel gelişimsel büyük ölçekli için genetik çalışmalar birçok alanları için güçlü bir model olarak ortaya çıktı ve1,2kimyasal ekranlarında. Basit, kolay kullanımı, geliştirilmesi için ticari olarak açmıştır tek hücreli zigot içine genetik materyal mikroenjeksiyon gen overexpression, nakavt, CRISPR/Cas9 mutagenesis ve transgenesis gibi rutin genetik manipülasyon itimat Yönlendirme ve yumurta enjeksiyon3için sabitleme için araçlar. Nakli ve enfeksiyon, gibi diğer yaklaşımlar genellikle mikroenjeksiyon sonraki sahne embriyo ve daha büyük ölçüm kapiller iğneler4kullanarak larva gerektirir. Ancak, hedef doku iterek veya embriyo haddeleme olmadan nüfuz daha zor olduğu gibi daha büyük gauge iğne kullanımı önemli teknik sorunlar, sunar. Bu koşullar altında işlem sırasında kurutma kaçınmak zor olsa embriyo stabilize etmek için gereken uygun su gerginlik ve embriyo elde etmek hedef doku içine enjeksiyon için ideal odaklı olabilir.
Mikroenjeksiyon, enjekte embriyo başarıyla enjekte seçin ve başlangıç zaman noktası görüntülerini yakalamak için ekran yararlıdır. Bu sorunları ele almak üzere, çeşitli yönleriyle mikroenjeksiyon5için hem hızlı görüntü tabanlı tarama sonrası enjeksiyon için 2 dpf embriyo dengelemeye yardımcı microstructured cihazları bir dizi geliştirdi.
Bu cihazlar içinde yeterli yapısal kararlılık elde etmek için photolithographic teknikleri kullanılmıştır. Mikroelektronik sanayi ve daha yakın zamanda yaygınlaştırılması mikrosıvısal imalat için yaygın olarak kullanılan, bu yaklaşımlardan 1-1000 µm, Zebra balığı embriyo ve larva manipülasyon için uygun bir ölçek uzanan dikey yapıları elde edebilirsiniz. Tüm aygıtlar kullanarak ucuz, fiziksel olarak sağlam, biyolojik olarak inert ve şeffaf olan polydimethylsiloxane (PDMS), fabrikasyon.
Microstructured yüzey diziler (MSAs) PDMS taşları desenli bir üst yüzeyi olarak biçimlendirilmiş, benzer şekilde özel bloklar halinde basit kanalları daha yaygın olarak kullanılan yumurta mikroenjeksiyon için. Sonrası enjeksiyon tarama için 6 görüntüleme aygıtları bir standart cam popolu 6-şey tabak içinde dizilmiş. Bu cihazlar embriyo kolay yükleme için tasarlanmış, kaldırma yordamı uygun görüntü tabanlı kurtarma kolaylaştırmak belirli embriyo izin verirken bu aygıtları daha daha kullanıcı dostu bir şekilde yaklaşımlar eleme daha önce tarafından geliştirilen Beebe laboratuvar6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, nasıl kullanılacağını açıklar biz son zamanlarda 2 dpf Zebra balığı mikroenjeksiyon5kolaylaştırmak ve basit özel ücretsiz montaj aygıt için uygun görüntüleme embriyo tanıtmak için geliştirdiler. Bu araçlar imalat Zebra balığı teknikleri için yararlı aygıt için photolithographic teknikleri yardımcı programı vurgulayın.
MSA aygıtları özellikle yararlı için hücreleri veya parçacıklar enjeksiyon eğilimli toplama mikroenjeks…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar David Langenau cömertçe akvaryum yer verdiğiniz için teşekkür etmek istiyorum; Eric Stone, John C. Moore ve Qin Tang için Zebra balığı bakım ve reaktifler ve Anne Robertson ve Elliott Hagedorn burada kullanılan Zebra balığı zorlanma tedarik için Leonard Zon’ın Laboratuarı’ndan yardım. Onlar da Octavio Hurtado photolithographic teknikleri tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorum. FE Shriner’ın hastaneden Arkadaş grupları tarafından çocuk ve Amerikan Avustralya Derneği için finanse edildi. Bu eser NIH tarafından finanse edildi GM92804 verin.
Materials
| Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhsives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator |
| Low gelling temperature agarose | Sigma Aldrich | A9414-10G | For casting agarose devices |
| PFDTS silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | For casting of negative PDMS molds |
| Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-10G | To anesthetize zebrafish |
| Rhodamine Dextran 70,000 Da | ThermoFisher | D1818 | To trace microinjections |
| Leukotriene B4 (LTB4) | Cayman Chemicals | 20110 | Neutrophil chemoattractant |
| N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP) | Sigma Aldrich | F3506-50MG | Neutrophil chemoattractant |
| 15 cm Petri dish | Fisher scientific | 08-757-148 | For Casting from the master wafer |
| Glass-bottom 6-well plates | MatTek | P06G-0-20-F | For imaging devices |
| Borosilicate glass microcapillaries | World Scientific Instruments | TW-100-4 | For microinjection needles |
| Transfer pipettes | Sigma Aldrich | Z350796 | For transferring zebrafish embryos |
| Microloader tips | Fisher scientific | E5242956003 | For loading the microinjection needles |
| Harris Uni-Core 1.5 mm punch | Ted Pella Inc. | 15111-15 | To punch ports in PDMS imaging devices |
| No. 11 Scalpel | Fine Science Tools | 10011-00 | For cutting PDMS |
| Dumont No. 5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-10 | For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips |
| Marzhauser Micromanipulator | ASI | MM33-R | For manipulating microinjection needle |
| Magnetic stand | MSC | SPI – 87242624 | For mounting micromanipulator |
| MPPI-3 Picopump controller | ASI | MPPI-3 | To control microinjection volume and timing |
| EVOS inverted fluorescent microscope | ThermoFisher | EVOS FL | To image injected embryos |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ745 | For visualizing microinjecion |
| AutoCAD software | Autodesk | Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki |
Referências
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).
- Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish. Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Ellett, F., Irimia, D. Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).
- Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J Vis Exp. (119), (2017).
- Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique. Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).
- Bhuiyan, M. S., et al. Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).
- Henry, K. M., et al. PhagoSight: an open-source MATLAB® package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model. PloS one. 8 (8), e72636 (2013).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).
- Hemmilä, S., Cauich-Rodríguez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces. Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research. Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).
- Wielhouwer, E. M., et al. Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system. Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).
- Shen, Y. C., et al. A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development. Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).
- Li, Y., et al. Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity. PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).
- Akagi, J., et al. Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos. PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).
- Akagi, J., et al. Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays. Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).
- Lin, X., et al. High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates. Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).
- Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control. Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).
