En automatiseret hurtige iterativ Negative Geotaxis analyse til at analysere voksen klatring adfærd i en Drosophila Model af Neurodegeneration
Summary
Denne trinvise protokol analyserer Drosophila negativt geotaxis adfærd ved hjælp af en automatiseret multi-cylindret system, der er vært for hundredvis af fluer og synkroniserer deres handling af en elektromotor. Ved synkronisering, er flyve negativt geotaxis adfærd analyseret, digitalt optaget, og analyseres ved hjælp af selvstændige designet RflyDetection software.
Abstract
Neurodegenerative sygdomme er ofte forbundet med en fremadskridende tab af bevægelse evne, reduceret levetid og alder afhængige neurodegeneration. For at forstå mekanismen af disse cellulære der begivenheder, og deres kausale relationer med hinanden, Drosophila melanogaster, med sin avancerede genetiske værktøjer og forskelligartede adfærdsmæssige træk, bruges som sygdomsmodeller for vurdering af neurodegenerative fænotyper. Her beskriver vi en høj overførselshastighed metode til at analysere Drosophila voksen negativt geotaxis adfærd, som en betegnelse for mulige motor fejl forbundet med neurodegeneration. En automatiseret maskine er designet og udviklet til at drive flyve synkronisering ved hjælp af en indledende elektrisk impuls, senere at tillade registrering af negativt geotaxis adfærd over et kursus i sekunder til minutter. Billeder fra digitalt optaget video behandles derefter med den selvstændige designet RflyDetection software til statistiske datamanipulation. Forskellige fra manuelt kontrolleret negative geotaxis analysen baseret på enkelt flue, denne præcise, hurtige og høj overførselshastighed protokollen tillader dataopsamling fra mere end hundredvis af fluer samtidigt, at yde en effektiv metode til at fremme vores forståelse i den underliggende mekanisme i bevægeapparatet underskud forbundet med neurodegeneration.
Introduction
En række protokoller og metoder er blevet udviklet til at analysere Drosophila voksen klatring adfærd. Temmelig besværlig, den traditionelle analyse for det meste indebærer, at en enkelt flue ind i en individuel hætteglas og bruger en manuel kraft til at trykke flyver ned til synkronisering1,2,3,4. Det er trættende og tidskrævende, uegnet til stor høj overførselshastighed undersøgelser, og har potentielle varianter af den manuelle magtanvendelse til at trykke ned fluer samt andre begrænsninger. For at forbedre analysen, blev en hurtig iterativ Negative Geotaxis (RING) analysen udviklet som giver høj overførselshastighed analyse over mange fluer på samme tid5. Analysen kræver imidlertid stadig et manuelt udøve kraft til at synkronisere flyve handling. Vores version af RING assay, revideret ved den foregående analyse, omfatter en metal base hosting flere flyve-holdige hætteglas automatisk styret af en elektromotor til at køre flue synkronisering6. Efter optagelse, fluen klatring umiddelbart efter synkronisering er optaget derefter analyseret ved hjælp af en selvstændig designet software. Vores automatiserede RING assay har elimineret den kedelige og arbejdskrævende proces med at indsamle data fra en enkelt flue, en ad gangen, og aktiveret data erhvervelse processen mere effektivt. Derudover har automatiseret RING analysen været ansat i en række undersøgelser for at belyse den mekanisme underliggende Alzheimers og Parkinsons sygdom, validering tilgang med høj effektivitet7,8,9 .
I denne artikel viser vi den automatiserede RING analyse ved hjælp af DDC-Gal4 drevet RNAi fluer. DDC-Gal4 er en Gal4 linje specifikt at udtrykke i dopaminerge (DA) og serotonerge neuroner, der således repræsenterer et fantastisk værktøj til at analysere target gen effekter forbundet med bevægeapparatet underskud ledsager neurodegeneration10. Derudover vil vi indarbejde UAS-Dicer2, en fluelinen, der forbedrer RNAi effektivitet, for at generere UAS-Dicer2; DDC-Gal4 værktøj line. RNAi flyver vi vælger at bruge er auxilin (aux) RNAi v16182 (auxR16182), et gen, som vi har tidligere identificeret til at udstille en effekt på flyve bevægeapparatet aktivitet8. auxGFP fluer er også forberedt til at analysere virkningerne på aux overekspression. Vi vil vise hvordan du bruger automatiseret RING analysen til at måle flyve negative geotaxis, fremlægge resultaterne og drøfte eventuelle konsekvenser erhvervet fra resultaterne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Automatiseret RING analysen beskrives her giver mulighed for en høj overførselshastighed analyse af flyve negativt geotaxis adfærd til hundredvis af fluer samtidigt. Tidligere eksisterende strategier til at analysere voksen klatring indebærer observation af en enkelt flue i en individuel hætteglas, og flyve position registreres manuelt af øjet. Denne temmelig kedelig proces kan undertiden forårsage misforståelse eller fejlfortolkning af data samt arbejdskrævende arbejde. Vores automatiserede RING assay starter m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Bloomington Stock Center og Vienna Drosophila RNAi Center for flyve bestande. Patent for apparatet RING hører til Shanghai Advanced Research institute, kinesiske Academy of Sciences. Anmodninger om RflyDetection software bør gøres til Fu-de Huang (Se forfatter liste). Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National grundlæggende forskning Program af Kina (973 Program 2013CB945602) og National Natural Science Foundation of China (31270825 og 31171043). Vi takker Ho lab medlemmer for diskussion og kommentarer.
Materials
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
Referências
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
- Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
- Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
- Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer’s Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
- Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson’s Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
- Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
- Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).
