En automatisert rask iterativ Negative Geotaxis analysen for å analysere voksen klatring atferd i Drosophila modell av Neurodegeneration
Summary
Denne trinnvise protokollen analyserer Drosophila negative geotaxis atferd med et automatisert system for multi sylinder som vert hundrevis av fluer og synkroniserer sine handlinger av en elektrisk motor. Ved synkronisering, er fly negative geotaxis atferd assayed, digitalt registrerte og analysert ved hjelp av egenutviklede RflyDetection programvare.
Abstract
Nevrodegenerative sykdommer er ofte forbundet med en progressiv tap av bevegelsen evne, redusert levetid og alder-avhengige neurodegeneration. Forstå mekanismen av disse mobilnettet brukes hendelser og deres årsaksforhold med hverandre, Drosophila melanogaster, med sin sofistikerte genetisk verktøy og variert atferdsmessige funksjoner, som sykdom modeller for å vurdere nevrodegenerative fenotyper. Her beskriver vi en høy gjennomstrømming metode for å analysere Drosophila voksen negative geotaxis oppførsel, som en indikasjon på mulig motor feil forbundet med neurodegeneration. En automatisert maskin er designet og utviklet for å kjøre fly synkronisering ved hjelp av en innledende elektrisk impuls, senere slik at innspillingen av negative geotaxis oppførsel i løpet av sekunder til minutter. Bilder fra digitalt innspilt video behandles deretter med egenutviklede RflyDetection programvaren for statistiske datamanipulasjon. Forskjellig fra manuelt kontrollert negative geotaxis analysen basert på enkelt fly, denne presise, rask og høy gjennomstrømming protokollen tillater datainnsamling fra mer enn hundrevis av fluer samtidig, gir en effektiv tilnærming til fremme våre forståelse i underliggende mekanismen av locomotor underskudd tilknyttet neurodegeneration.
Introduction
En rekke protokoller og metoder har blitt utviklet for å analysere Drosophila voksen klatring atferd. Ganske arbeidskrevende, tradisjonelle analyser det meste innebærer å plassere en enkelt fly i en enkelt medisinglass og bruker en manuell kraft trykke flyr ned for synkronisering1,2,3,4. Det er kjedelig og tidkrevende, uegnet for store høy gjennomstrømming studier, og har potensielle varianter av manuell kraften brukes til å trykke ned fluene samt andre begrensninger. For å forbedre analysen, utviklet en rask iterativ Negative Geotaxis (RING) analyse som lar høy gjennomstrømming analyse over mange fluer på samme tid5. Analysen krever imidlertid fortsatt en manuelt øve kraft til å synkronisere fly handling. Vår versjon av RING analysen, revidert på forrige analysen, inkluderer en metallisk basis hosting flere fly inneholder ampuller automatisk blir kontrollert av en elektrisk motor for å kjøre fly synkronisering6. Ved opptak, fly klatring umiddelbart etter synkronisering registreres deretter analysert benytter en egenutviklede programvare. Våre automatiserte RING analysen har eliminert den kjedelige og arbeidskrevende prosessen i innsamling av data fra en enkelt fly, en om gangen, og aktivert data oppkjøpet bli mer effektiv. I tillegg har automatisert RING analysen vært ansatt i en rekke studier for å belyse mekanisme underliggende Alzheimers og Parkinsons sykdom, validere tilnærming med høy effektivitet7,8,9 .
I denne artikkelen viser vi automatisert RING analysen med DDC-Gal4 drevet RNAi fluer. DDC-Gal4 er en Gal4 linje spesielt uttrykke i dopaminergic (DA) og serotonergic neurons, og dermed representerer et flott verktøy for å analysere målet genet effektene knyttet locomotor underskudd følger neurodegeneration10. I tillegg innlemme vi UAS-Dicer2, en fly linje som forbedrer RNAi effektivitet, for å generere UAS-Dicer2; DDC-Gal4 verktøyet linje. RNAi fluene vi velger å bruke er auxilin (aux) RNAi v16182 (auxR16182), et gen som vi tidligere har funnet for å ha en effekt på fly locomotor aktivitet8. auxGFP flyr er også utarbeidet for å analysere virkningene på aux overuttrykte. Vi vil vise hvordan du bruker automatiserte RING analysen å måle fly negative geotaxis presentere resultatene og diskutere noen implikasjoner fra resultatene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Automatisert RING analysen beskrevet her kan en høy gjennomstrømming analyse av fly negative geotaxis for hundrevis av fluer samtidig. Tidligere eksisterende strategier for å analysere voksen klatring involverer observasjoner av en enkelt fly i en enkelt medisinglass og fly posisjon registreres manuelt av øyet. Denne ganske kjedelige prosessen kan noen ganger forårsake feiltolking eller feiltolkning av data, samt arbeidskrevende arbeid. Analysen vår automatiserte RING starter med et enkelt klikk, og apparatet autom…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Bloomington lager sentrum og Vienna Drosophila RNAi Center for fly aksjer. Patentet for RING apparatet tilhører Shanghai Advanced Research institute, kinesiske vitenskapsakademi. Forespørsler om RflyDetection programvaren gjøres til Fu-de Huang (se forfatteren). Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra nasjonale grunnleggende forskning Program i Kina (973 Program 2013CB945602) og National Natural Science Foundation i Kina (31270825 og 31171043). Vi takker Ho lab medlemmer for diskusjon og kommentarer.
Materials
| Forma Environmental Chamber | Thermo | 3949 | |
| Carbon dioxide cylinders | FuLian GAS Technology | GB/T6052 | |
| HDR-Camcorder | SONY | HDR-CX220E | |
| Binocular stereomicroscope | Xin Zhen | SMZ-168BL | |
| Electronic scales | MinQiao | SL1002N | |
| Refrigerator | Haier | SC-350 | |
| Agar-agar powder | Sinopharm | 10000561 | |
| Glucose | Sinopharm | 10010518 | |
| Corn meal | Sinopharm | 5464654 | |
| Brown sugar | LiuCaiYuan | 45467936 | |
| Instant dry yeast | AB MAURI | 20886 | |
| AuxR16182 | VDRC | 7187 | |
| UAS-Dicer2 | Bloomington | 24650 | |
| UAS-mCD8GFP | Bloomington | 32185 | |
| DDC-Gal4 | A gift from Fude Huang | ||
| AuxGFP | A gift from Henry Chang |
Referências
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
- Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741 (2015).
- Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
- Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer’s Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
- Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson’s Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
- Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
- Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).
