Сочетание митотическая клеток синхронизации и конфокальная микроскопия высокого разрешения для изучения роли многофункциональный клеточного цикла белков во время митоза
Summary
Мы представляем протокол для двойной тимидина синхронизации клеток HeLa, следуют анализ с использованием конфокальная микроскопия высокого разрешения. Этот метод является ключом к получению большое количество клеток, что синхронно с S-фазе митоза, позволяя исследования митотическая роли многофункциональный белков, которые также обладают функциями межфазной.
Abstract
Изучение различных нормативных событий в зависимости от фазы клеточного цикла обеспечивает четкое понимание о деление и рост клеток. Было установлено, что синхронизация клеточных популяций на определенных стадиях клеточного цикла будет весьма полезным в таких экспериментальных начинаниях. Над использованием фармакологических ингибирующих наркотиков для изучения событий последующего клеточного цикла и для получения конкретных обогащения отдельных этапов митотическая синхронизации клеток по обращению с химическими веществами, которые являются относительно менее токсичные может быть выгодным. Здесь мы описываем протокол для синхронизации клеток человека на разных этапах клетки цикла, включая как в S фаза и фаза M с блоком двойной тимидин и освободить процедуры для изучения функциональность митотическая белков в хромосоме выравнивания и сегрегации. Этот протокол был чрезвычайно полезным для изучения митотическая роли многофункциональный белков, которые обладают установленным межфазной функций. В нашем случае митотическая роль Cdt1, белок, критических для репликации происхождения лицензирования в фазе G1, могут изучаться эффективно только тогда, когда G2/M-конкретных Cdt1 может быть исчерпана. Мы описываем подробный протокол для истощения G2/M-конкретных Cdt1 с помощью двойной тимидина синхронизации. Мы также объяснить протокол фиксации клеток и живой клетки изображений с помощью конфокальная микроскопия высокого разрешения после выпуска тимидина. Этот метод также полезен для анализа функции митотическая белков как физиологические, так и возмущенных условиях как для Hec1, компонент Ndc80 комплекс, поскольку он позволяет получить большой выборки митотическая клеток для фиксированной и живой клетки анализ как мы показываем здесь.
Introduction
В клеточный цикл клетки проходят серию жестко регулируемых и височно контролируемых событий для точного дублирования их геном и распространения. В млекопитающих клеточный цикл состоит из межфазной и M-фазы. В интерфазе, который состоит из трех этапов – G1, S, и G2, ячейка дублирует его генома и подвергается роста, который необходим для нормального клеточного цикла прогрессии1,2. В M-фаза, которая состоит из цитокинез и митоз (профаза, Прометафаза, метафаза, анафазе и Телофаза), родительские ячейки производит две генетически идентичных клеток дочи. В митозе, сестра chromatids дублированный генома, конденсированной (профаза) и на их kinetochores, захвачен микротрубочек собрал митотического веретена (Прометафаза), что заставляет их выравнивание на пластину метафазы (метафаза), следуют их равных сегрегации, когда сестра chromatids Сплит сторону и перевезены в противоположный шпиндель мачты (анафазе). 2 клетки дочи физически отделены деятельности на основе актина сократительной кольца (Телофаза и цитокинез). Кинетохор — это специализированный белковых структура, которая собирает в регионе прицентромерного chromatids и служить в качестве вложения сайты для шпинделя микротрубочек. Его основная функция заключается в диск хромосома захвата, выравнивание и помощь в коррекции неправильного шпинделя микротрубочек вложения, при посреднической шпинделя Ассамблеи контрольно-пропускной пункт сохранить верность хромосома сегрегации3,4.
Метод синхронизации клетки служит идеальным инструментом для понимания молекулярных и структурных мероприятий, участвующих в прогрессии клеточного цикла. Этот подход использовался для обогащения клеточных популяций на конкретных этапах для различных видов анализа, включая профилирование экспрессии генов, анализ клеточных биохимических процессов и выявления локализации внутриклеточных белков. Синхронизированные mammalian клеток может использоваться не только для изучения отдельных генов продуктов, но и для подходов, включающих анализ всего геномов, включая анализ microarray ген выражение5, Мирна выражение модели6, Переводческая правила7и протеомного анализа белка модификации8. Синхронизации может также использоваться для изучения последствий экспрессии генов и белков нокдаун или нокаут-, или химических веществ на клеточный цикл прогрессии.
Клетки могут быть синхронизированы на различных стадиях клеточного цикла. Физические и химические методы широко используется для синхронизации клеток. Наиболее важными критериями для синхронизации клеток являются, что синхронизация должна быть noncytotoxic и обратимым. Ввиду возможных негативных последствий сотовой синхронизации клетки фармакологическими агентами химико зависимые методы может быть выгодным для изучения ключевых клеточного цикла событий. К примеру гидроксимочевина, amphidicolin, mimosine и Ловастатин, может использоваться для синхронизации клеток в фазе G1/S но, из-за их влияния на биохимические пути, который они подавляют, они активировать клеточный цикл контрольно-пропускной пункт механизмов и убить является важным часть клетки9,10. С другой стороны обратной связи торможение репликации ДНК, добавив тимидина к росту СМИ, известный как «тимидина блок», могут арестовать клеточного цикла в определенные точки11,12,13. Клетки также могут быть синхронизированы на этапе G2/M, рассматривая с Нокодазол и RO-33069,14. Нокодазол, который предотвращает сборки микротрубочек, имеет относительно высокий цитотоксичности. Кроме того арестован Нокодазол клетки могут вернуться к межфазное благосклонностью, митотическая проскальзывания. Двойной тимидина блок арест клетки в фазе G1/S и после выхода из блока, клетки находятся синхронно продолжить через G2 и в митозе. Обычной прогрессии клеточного цикла для ячеек, освобождены от тимидина блока можно наблюдать под конфокальная микроскопия высокого разрешения ячейки фиксации или живой изображений. Эффект возмущений митотическая белков могут быть изучены, специально когда клетки ввести и перейти через митоз после освобождения от двойной тимидина блока. Cdt1, многофункциональный белков, участвует в ДНК репликации лицензирования происхождения в фазе G1 и требуется также для Кинетохор микротрубочки вложений во время митоза15. Чтобы изучить функции Cdt1 во время митоза, необходимо принять метод, который позволяет избежать эффекта его истощения на репликации лицензирования во время фазы G1, хотя в то же время осуществление его истощении, специально во время фазы G2/М только. Здесь мы представляем подробные протоколы, основанные на блоке двойной тимидина изучение митотического роль белков, выполняет несколько функций в различных стадиях клеточного цикла, как фиксированной, так и клеток изображений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важным преимуществом двойной тимидина синхронизации является, что она обеспечивает увеличения размера выборки митотическая клеток в окне короткое время со многими из этих клеток, введя митоз в унисон, позволяя также анализ хромосом выравнивание, биполярный шпинделя формиро?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны д-р Козо Танака Университета Тохоку, Япония для обмена клетки HeLa, стабильно выражая гистона mCherry H2B и GFP-α-тубулина. Эта работа была поддержку NCI Грант для DV (R00CA178188) и начальных средств от северо-западного университета.
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
Referências
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
- Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
- Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).
- Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
- Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
- Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
- Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
- Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
- Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
- Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
- Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
- Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
- Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
- Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
- Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).
- Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
- Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).
