Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages
Summary
Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour l’isolement de Salmonella typhimurium-contenant des phagosomes des macrophages en enduisant les bactéries avec biotine et streptavidine.
Abstract
Salmonella typhimurium est une bactérie intracellulaire facultative qui provoque la gastro-entérite chez les humains. Après l’invasion de la lamina propria, S. Typhimurium bactéries sont rapidement détectés et phagocytose par les macrophages et contenues dans les vésicules appelés phagosomes afin d’être dégradée. Isolement de S. Typhimurium-phagosomes contenant ont été largement utilisées pour étudier comment S. Typhimurium infection modifie le processus de maturation du phagosome pour empêcher la dégradation bactérienne. Classiquement, l’isolement des bactéries contenant les phagosomes a été réalisée par centrifugation en gradient de saccharose. Toutefois, ce processus prend du temps et nécessite un équipement spécialisé et une certaine dextérité. Décrite ici est une méthode simple et rapide pour l’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes des macrophages en enduisant les bactéries avec des billes magnétiques conjugué streptavidine-biotine. Les phagosomes obtenus par cette méthode peuvent être suspendus dans un buffer quelconque de choix, ce qui permet l’utilisation des phagosomes isolés pour un large éventail de tests, tels que l’analyse de protéines, lipides et métabolite. En résumé, cette méthode d’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes est précis, efficace, rapide, nécessite l’équipement minimal et est plus souple que la méthode classique d’isolement par gradient de saccharose-ultracentrifugation.
Introduction
Macrophages circulent des cellules phagocytaires spécialisées qui détectent, engloutissent et dégradent toute particule étrangère présente dans les tissus périphériques, allant des cellules apoptotiques à envahir les micro-organismes comme les bactéries. Dès la surface médiée par les récepteurs de reconnaissance de marqueurs spécifiques pathogène communément présentes à la surface des microorganismes (appelés profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés ou PAMPs), macrophages initier une réorganisation complexe de la membrane cellulaire en afin d’entourer et de phagocyter l’ agent pathogène1.
L’agent pathogène phagocytée figure ensuite par les macrophages dans une vésicule intracellulaire appelé phagosome. Grâce à une série de fusion et d’événements de fission avec autres vésicules comme endosomes et les lysosomes, le phagosome contenant des agents pathogènes acquiert un ensemble de protéines nécessaires à l’élimination du contenu phagosome. Par conséquent, la composition enzymatique du phagosome est très variable au cours de ce processus, appelé phagosome maturation2.
Peu de temps après la phagocytose, les multimères complexe ATPase vacuolaire (v-ATPase) est incorporé dans la membrane du phagosome par fusion avec les endosomes3. Ce complexe utilise l’ATP aux protons de la pompe du cytosol vers la lumière du phagosome4. L’acidification du phagosome est essentielle pour les événements de fusion avec d’autres vésicules5 et pour l’activation d’un grand nombre d’enzymes de dégradation dépend du pH6. Un autre complexe enzymatique multimériques qui est rapidement monté sur la membrane du phagosome est le complexe NADPH oxydase (NOX). NOX complexe oxyde NADPH afin de produire des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui sont sécrétés dans la lumière du phagosome et qui contribuent significativement à la mise à mort des micro-organismes ingérés7.
Pendant les premières étapes de maturation, phagosomes présentent marqueurs généralement comme Rab5 et Rab7 des endosomes précoces et tardifs respectivement avec la sous-unité de0 V de la v-ATPase8. Fusion des phagosomes avec les lysosomes et endosomes fin se traduit par l’exposition de l’agent pathogène phagocyté à une grande variété d’enzymes hydrolytiques telles que la cathepsine protéases, lipases et9de la β-galactosidase. L’acidification de la lumière est également nécessaire pour l’activation de ces enzymes. Par exemple, le clivage de la cathepsine D pour produire la forme abrégée active est dépendante du pH10. Ces enzymes dégradent l’agent pathogène et agir comme médiateur de la production de peptides courts pathogène dérivées qui sont présentés par les macrophages majeur d’histocompatibilité (MHC) classe II des molécules complexes de lymphocytes T pour déclencher une réponse immunitaire adaptative11.
Par conséquent, maturation phagosome est cruciale pour la réponse immunitaire innée et relie les bras innées et adaptatives du système immunitaire. C’est sans surprise que les pathogènes ont évolué des stratégies pour surmonter l’élimination par les macrophages à travers le processus décrit ci-dessus de la maturation du phagosome. Par exemple, la bactérie intracellulaire, Mycobacterium tuberculosis et Legionella pneumophila empêche la maturation phagosome par Assemblée de v-ATPase inhibiteur et lumen conséquente l’acidification12,13 . D’autres bactéries, comme Listeria monocytogenes ou Shigella flexneri induisent la formation de pores dans la membrane du phagosome s’échapper dans le cytosol14,15. En revanche, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) est capable de modifier les propriétés du phagosome dans la vacuole pour le transformer en un endroit approprié pour sa réplication16. Cette capacité en fait S. typhimurium un modèle très intéressant pour étudier les interférences induite par l’agent pathogène de la maturation du phagosome.
S. typhimurium est une bactérie intracellulaire facultative qui provoque la gastro-entérite chez les humains. Après l’invasion de la lamina propria, S. Typhimurium bactéries sont rapidement détectés et phagocytose par les macrophages et contenues dans les phagosomes17. Certains rapports ont décrit précédemment S. Typhimurium-phagosomes contenant présentent à thé pour les endosomes et les lysosomes18, et autres études ont révélé la fusion phagosome-lysosome empêchée sur S. Typhimurium infection19.
Au départ, phagosome maturation sur S. Typhimurium infection a été étudiée par microscopie d’immunofluorescence. Le développement des techniques d’isolement de bactéries contenant les phagosomes a permis une étude plus précise du contenu en termes de marqueurs endosome et lysosome phagosome. À ce jour, la principale méthode utilisée pour l’isolement des bactéries contenant les phagosomes est le fractionnement subcellulaire le saccharose étape dégradés18,20. Toutefois, cette méthode nécessite plusieurs étapes de centrifugation qui peuvent causer des dommages mécaniques aux phagosomes, peuvent influer sur la stabilité des composants phagosome (protéines et lipides) et prend du temps. En outre, il nécessite l’utilisation d’une ultracentrifugeuse : une pièce d’équipement spécialisé qui n’est pas accessible pour tous les laboratoires.
Récemment, une nouvelle approche a été appliquée à l’isolement bactérien contenant des phagosomes, dans lequel les bactéries pathogènes sont étiquetés avec lipopetide biotinylé (Lipobiotin) et plus tard extraite à l’aide de billes magnétiques conjugué streptavidine21 . Nous vous proposons une méthode alternative complémentaire par marquage bactériennes surfaces contenant des amines macromolécules avec NHS-biotine suivie de billes magnétiques conjugué streptavidine. Les phagosomes obtenus par cette méthode sont fortement enrichis en marqueurs endosome et lysosome et peuvent être utilisés pour un large éventail de tests, de l’analyse de la protéine à omics analyse. En outre, il ne nécessite pas d’équipement spécialisé comme ultracentrifugeuses. De plus, en éliminant les étapes de centrifugation, les dommages mécaniques aux phagosomes tant la quantité de temps employé sont réduites considérablement. Cette méthode peut être facilement adaptée pour l’isolement des phagosomes contenant d’autres bactéries telles que les Gram positif Staphylococcus aureus, également inclus dans ce manuscrit. En résumé, cette méthode d’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes est un simple, rentable, et moins de temps que l’isolation classique de saccharose gradient-ultracentrifugation, rendu hautement enrichi phagosomes contenant des bactéries.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une nouvelle méthode d’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes en enduisant les bactéries avec biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine est décrite ici. Après perturbation douce de la membrane cellulaire, phagosomes contenant des bactéries peuvent être facilement extraites à l’aide d’un support magnétique. Nous montrons que l’étiquetage des bactéries conserve la capacité de l’agent pathogène d’induire une inflammation et n’altère pas la propriété p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Recherche au laboratoire de la Robinson est financée par Cologne Cluster d’Excellence sur les réactions de Stress cellulaire dans les maladies Aging-Associated, Université de Cologne, Allemagne (CECAD ; subventionné par la DFG au sein de l’Initiative d’Excellence de la fédérale et gouvernements des États) et les subventions accordées par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln Fortune et Maria-Pesch Fondation de l’Université de Cologne (Allemagne).
Materials
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
Referências
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