내가 조직 공학에 대 한 마우스 Cochleae Decellularizing에 대 한 프로토콜
Summary
이 프로토콜의 목표 decellularize 알려줍니다 마우스 cochleae 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 공중 발판으로 이용 하는 효과적인 방법 설명 하는 것입니다.
Abstract
포유류에서 청각 부족을 재생성 하는 기능을 촉진 하는 mechanosensory 세포는 청력 손실에 대 한 치료를 제한 했다. 현재 재생 의학 전략 이식 줄기 세포 또는 주변 청각 상실을 해결 하기 위해 손상 된 줄기 세포의 교체를 장려 하는 내가 지원 세포의 유전자 조작에 집중 했다. 그러나, 기질 (ECM) 유도 하 고 세포의 기능 유지에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 그리고 잘 조사 하지. 인공 와우를 사용 하 여 성체 줄기 세포를 성장 하는 발판으로 ECM 어떻게 구성 및 extracellular 환경 아키텍처 셀에 에이즈 청력 기능을 유지 하는 독특한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기 우리는 분리 하 고 건설 기계 성인 줄기 세포 끼얹는다 수락으로 사용 하는 마우스에서 cochleae를 decellularizing 하는 방법을 제시. 현재 프로토콜에서 cochleae 안락사 쥐, decellularized, 그리고 석 으로부터 격리 됩니다. 그 후, 탯 줄에서 고립 된 인간의 튼 젤리 셀 (hWJCs) 각 달팽이 관에 끼얹는다 신중 하 게 했다. cochleae 생물 반응 기, 사용 하 고 셀 분석에 대 한 처리를 진행 하기 전에 30 일 동안 배양 되었다. Decellularized cochleae 식별 extracellular 구조를 유지 하지만 DNA의 현저한 조각 또는 셀의 존재를 공개 하지 않았다. 셀 달팽이 관에 끼얹는다 인테리어와 달팽이 관의 외관의 대부분을 침공 하 고 30 일의 기간 동안 사고 없이 성장 했다. 따라서, 현재 방법 어떻게 인공 ECM에 영향을 미치는 세포 발달 및 행동 연구를 사용할 수 있습니다.
Introduction
달팽이 관은 측 뼈에서 발견 하는 복잡 한 나선형 구조. 그것은 외부 뼈 미로 동심, 내부 membranous 미로1로 구성. Membranous 미로 3 유체 공간 구성: 스칼라 vestibuli, 스칼라 언론과 Scala tympani1. 스칼라 미디어 하우스 수많은 종류의 세포로 구성 되어, 감각 상피, 하지만 감각 머리 세포 (HC), 신경 충 동2음파 기계적 에너지 transduce는 특정 관심의. 음향 외상3,,45, 약6, 질병7,8, 및 노화9 노출 모두 HC 죽음 통해 장애인된 청각 기능 발생할 수 있습니다. 포유류에서 머리 세포 손실 부상10후 재생성 수 조류 HCs 달리 영구적 이다.
다양 한 현대 연구 노력 하고자 했다 손실된 HCs 복원 특정 실험적인 접근 다르지만. 감각 상피에 유전자 발현의 조작 및 몸 밖에 서 분화 하는 줄기 세포의 주입은 필드에서 지배적인 접근 인공 organoids로 줄기 세포를 분화 하는 유도 방법 있다 지만 시도11,,1213. 이 방법의 각각은 줄기 세포 나 줄기 세포; 사용 발달 큐에 직접 의존 그러나, 두 번째 공유 하 고 잠재적으로 중요 한 요소는 달팽이 관 자체의 ECM14,15.
ECM 뿐만 아니라 세포와 조직, 세포 접착, 확산, 생존, 및 마이그레이션에 대 한 서피스를 포함 하지만 또한 HCs와 나선형 ganglion15,16의 개발에 중요 한 역할에 대 한 물리적 지원 제공 ,17. 자연스럽 게 발생 ECM는 세포 표현 형 결정 및 세포 접착, 확산, 그리고 생존18가이드 수 유도 신호를 제공 합니다. 따라서, 교양된 hWJCs와 함께에서 decellularized 달팽이 관의 사용 ECM HC 재생의 역할을 탐구 하는 독특한 기회를 제공 합니다. HWJCs는 중간 엽 줄기 세포19처럼 인간의 탯에서 고립 된 쉽게 사용할 수, 비 논란이 셀 유형입니다. HWJCs는 neurosensory 세포 계보20,21아래로 차별 하는 능력을 보여주었다. 따라서, 현재 프로토콜 절연, decellularization, 및 cochleae 내가 조직 공학에 대 한 hWJCs와 C57BL 마우스 시체에서의 관류 자세히 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 성공적으로 복잡 한 3 차원 조직 발판으로 달팽이 관의 사용을 허용 하는 decellularization 과정을 통해 달팽이 관에서 네이티브 인공 세포를 제거할 수 있습니다 시연 했다. 산 티 외. 15 decellularizing cochleae에 대 한 초기 방법을 개발 하 고 정확 하 게 빛 시트 현미경23의 도움으로 많은 인공 구조를 통해 볼륨 견적 했다. 이러한 초기 작업 조직 엔지니어?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
현재 프로젝트 개념 펀드의 캔자스의 대학 증거에 의해 투자 되었다. 우리는 cochleae 문화 지원에 대 한 인간의 탯, 그리고 데이비드 조 젠 슨은 취득에 우리 위한 KUMC (캔사스 시, KS)에서 간호 직원을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
Referências
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