Протокол для Decellularizing Cochleae мыши для внутреннего уха тканевая инженерия
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации эффективным методом для decellularize и известь cochleae мыши для использования как подмости для ткани инженерных приложений.
Abstract
В млекопитающих, mechanosensory клетки волос, которые облегчают отсутствие слуха способность к регенерации, которая имеет ограниченные лечения потери слуха. Нынешние стратегии регенеративной медицины были сосредоточены на трансплантации стволовых клеток или генетические манипуляции окружающих клетки поддержки внутреннего уха для поощрения замены поврежденных стволовых клеток для исправления потере слуха. Тем не менее внеклеточная матрица (ECM) могут играть жизненно важную роль в склонение и поддержание функции клетки волос и не хорошо исследовано. С помощью кохлеарной ECM как леска выращивать стволовые клетки могут обеспечить уникальные понимание как состав и архитектуры внеклеточных среды помогает клетки в поддержании функции слуха. Здесь мы представляем метод для изоляции и decellularizing cochleae от мышей для использования в качестве строительных лесов, принимая перфузии взрослых стволовых клеток. В текущем протоколе cochleae изолированы от Усыпленных мышей, decellularized и decalcified. Потом клетки человека Уортон желе (hWJCs), которые были изолированы от пуповины были тщательно увлажненную в каждом улитки. Cochleae были использованы как биореакторов, и клетки были культивированный на 30 дней перед прохождением обработки для анализа. Decellularized cochleae сохранила идентифицируемой внеклеточного структур, но не выявили наличие клеток или заметно фрагменты ДНК. Клетки, увлажненную в улитке захватила большую часть интерьера и экстерьера улитки и вырос без инцидентов в течение 30 дней. Таким образом текущий метод может использоваться для изучения как улитковый ECM влияет на развитие клеток и поведение.
Introduction
Улитки является сложной спиральной структуры, в височной кости. Он состоит из наружной костлявые лабиринта и концентрические, внутренний лабиринт membranous1. Лабиринт membranous состоит из трех пространств жидкости: vestibuli Скала, Скала средства массовой информации и скала литавры1. Скала издательства сенсорные эпителия, который состоит из множества типов клеток, но Сензорные клетки волос (HC), которые передают механическую энергию в звуковые волны для нервных импульсов2, представляют особый интерес. Воздействие Акустическая травма3,4,5, лекарства6,7,болезни8и старения9 может привести в нарушение слуховой функции через HC смерти. Потеря волос клеток млекопитающих является постоянным, в отличие от птичьего HCs, которые могут восстанавливаться после травмы10.
Целый ряд современных исследовательских усилий стремились восстановить потеряли HCs, хотя конкретные экспериментальные подходы различаются. Манипуляция экспрессии генов в эпителии сенсорные и Вживление стволовых клеток продифференцировано вне тела являются доминирующей подходы в этой области, хотя методы индукции, стремящихся дифференцироваться стволовых клеток в улитковый organoids были попытка11,12,13. Каждый из этих подходов является либо непосредственно зависит от стволовых клеток или развития подсказки, используемые стволовых клеток; Однако, второй совместно, и потенциально критические, элемент ECM улитки, сам14,15.
ЭХО не только обеспечивает физическую поддержку клетки и ткани, которая включает в себя поверхность для клеточной адгезии, распространения, выживания и миграции, но также играет важную роль в развитии HCs и спираль ганглия15,16 ,17. Естественно происходя ECM предоставляет индуктивный сигналы, которые могут направлять Определение фенотипа клетки или клетки адгезии, распространением и выживания18. Следовательно использование decellularized улитки в сочетании с искусственного hWJCs предлагают уникальную возможность изучить роль ECM и HC регенерации. HWJCs являются легкодоступными, неспорным ячейки тип изолированы от человеческого пуповины, которые ведут себя как мезенхимальные стволовые клетки19. HWJCs показали способности различать вниз нейросенсорные клеток линий20,21. Таким образом текущий протокол детали изоляции, decellularization и перфузии cochleae от туши C57BL мыши с hWJCs для внутреннего уха тканевой инженерии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы успешно продемонстрировали, что родной улитковый клетки могут быть удалены из улитки через процесс decellularization, который позволяет использовать улитки как сложную, трехмерные ткани эшафот. Санти и др. 15 разработал первоначальный метод для decellularizing cochleae и точно оценить…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Текущий проект финансировался университета Канзаса доказательство концепции фонда. Мы хотели бы поблагодарить медицинский персонал на KUMC (Канзас-Сити, KS) для оказания нам помощи в получении человека пуповины и Дэвид Йоргенсен для оказания помощи с cochleae культурами.
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
Referências
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
- LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
- Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
- Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
- Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
- Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
- Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere’s disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
- House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
- Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
- Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
- Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
- Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
- Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
- Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
- Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton’s Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
- Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton’s jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
- Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton’s Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
- Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
- Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
- Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).
