بروتوكول ديسيلولاريزينج كوكليا الماوس لهندسة الأنسجة الإذن الداخلية
Summary
والهدف من هذا البروتوكول إظهار وسيلة فعالة ديسيلولاريزي وديكالسيفي كوكليا الماوس للاستخدام السقالات لتطبيقات هندسة الأنسجة.
Abstract
في الثدييات، وخلايا الشعر ميتشانوسينسوري التي تيسر الاستماع الافتقار إلى القدرة على التجدد، التي حدت من العلاجات لفقدان السمع. استراتيجيات الطب التجديدي الحالية تركز على زرع الخلايا الجذعية أو التلاعب بالجينات المحيطة بدعم الخلايا في الإذن الداخلية لتشجيع استبدال التالف من الخلايا الجذعية لتصحيح السمع. ومع ذلك، المصفوفة خارج الخلية (ECM) قد تلعب دوراً حيويا في حفز والحفاظ على وظيفة خلايا الشعر، ولم يجر التحقيق فيها جيدا. استخدام cochlear إدارة المحتوى في المؤسسة سقالة لزراعة الخلايا الجذعية البالغة قد يوفر رؤى فريدة من نوعها في كيفية تكوين والهندسة المعمارية للبيئة خارج الخلية الإيدز الخلايا في الحفاظ على وظيفة السمع. هنا نقدم طريقة لعزل وديسيلولاريزينج كوتشلياي من الفئران لاستخدامها بمثابة السقالات قبول perfused الخلايا الجذعية البالغة. في البروتوكول الحالي، كوتشلياي يتم عزل من الفئران euthanized، ديسيلولاريزيد، وديكالسيفيد. بعد ذلك، تم بعناية perfused جيلي الخلايا البشرية وارتون (هوجكس) التي كانت معزولة من الحبل السري في كل قوقعة الإذن. واستخدمت في كوتشلياي كالمفاعلات الحيوية، وتم استزراع الخلايا لمدة 30 يوما قبل أن يخضع لتحليل تجهيز. كوكليا ديسيلولاريزيد الاحتفاظ بهياكل خارج الخلية يمكن تحديدها، ولكن لم يكشف عن وجود خلايا أو ملاحظته شظايا من الحمض النووي. اجتاحت معظم الداخلية والخارجية للقوقعة الخلايا perfused إلى القوقعة ونمت دون وقوع أي حادث خلال مدة 30 يوما. وهكذا، يمكن استخدام الأسلوب الحالي لدراسة كيف cochlear التنمية الخلية يؤثر على المحتوى والسلوك.
Introduction
القوقعة بنية معقدة دوامة موجودة في العظم الصدغي. وهو يتألف متاهة عظمى خارجي و متاهة membranous متحدة المركز، والداخلية1. متاهة ميمبرانوس يتكون من ثلاثة ممنوع السوائل: فيستيبولي سكالا، سكالا وسائط الإعلام، و حبل سكالا1. دور وسائط الإعلام سكالا ظهارة الحسية، التي تتألف من العديد من أنواع الخلايا، ولكن خلايا الشعر الحسية (المفوض السامي)، الذي ترانسدوسي الطاقة الميكانيكية في الموجات الصوتية للنبضات العصبية2، تتسم بأهمية خاصة. التعرض للصدمات الصوتية3،،من45،6من الدواء والمرض7،8والشيخوخة9 كل ما يمكن أن يؤدي وظيفة السمع البصر عن طريق الإعدام المفوض السامي. فقدان خلايا الشعر في الثدييات دائمة، على عكس HCs إنفلونزا الطيور، التي يمكن تجديدها بعد إصابة10.
مجموعة متنوعة من الجهود البحثية المعاصرة سعت إلى استعادة HCs المفقودة، على الرغم من اختلاف النهج التجريبية المحددة. التلاعب بالجينات في ظهارة الحسية وزرع الخلايا الجذعية التي ميزت خارج الجسم هي النهج السائد في الميدان، على الرغم من أن قد تم طرق الاستقراء التي تسعى إلى التفريق بين الخلايا الجذعية في cochlear أورجانويدس حاول11،،من1213. كل من هذين النهجين أما يعتمد مباشرة على الخلايا الجذعية، أو العظة التنموية المستخدمة من قبل الخلايا الجذعية؛ بيد أن المشتركة ثانية، ويحتمل أن تكون حاسمة، هو عنصر إدارة المحتوى المؤسسي للقوقعة نفسها14،15.
إدارة المحتوى في المؤسسة لا يوفر الدعم المادي للخلايا والأنسجة، والتي تشمل سطح لالتصاق الخلايا وانتشار، والبقاء على قيد الحياة، والهجرة، ولكن أيضا تلعب أدواراً حاسمة في تطوير HCs ودوامه العقدة15،16 ،17. وبطبيعة الحال يوفر إدارة المحتوى في المؤسسة التي تحدث إشارات الاستقرائية التي قد توجه تحديد النمط الظاهري الخلية و/أو خلية التصاق وانتشارها، وبقاء18. ونتيجة لذلك، استخدام القوقعة ديسيلولاريزيد في تركيبة مع هوجكس المستزرعة توفر فرصة فريدة لاستكشاف دور تجديد إدارة المحتوى في المؤسسة، والمفوض السامي. هوجكس هي نوع خلية متاحة بسهولة، وغير مثيرة للجدل المعزولة من حبل السرة البشرية التي تتصرف مثل الخلايا الجذعية الوسيطة19. وقد أظهرت هوجكس القدرة على التفريق بين أسفل الخلية الحسية الأنساب20،21. وهكذا، تفاصيل البروتوكول الحالي العزلة، وديسيلولاريزيشن، ونضح من كوكليا من جثث الماوس C57BL مع هوجكس للهندسة أنسجة الإذن الداخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد أظهرنا بنجاح أن يمكن إزالة الخلايا cochlear الأصلية من القوقعة عبر عملية ديسيلولاريزيشن، الذي يسمح باستخدام القوقعة سقالة أنسجة معقدة، ثلاثية الأبعاد. سانتي وآخرون. 15 تطوير أسلوب كوكليا ديسيلولاريزينج الأولية، ودقة ويقدر حجم العديد من الهياكل cochlear عن طريق مع المعونة م?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بإثبات جامعة كانساس مفهوم صندوق تمويل المشروع الحالي. نود أن نشكر موظفي التمريض في كومك (كانساس سيتي، كانساس) لمساعدتنا في الحصول على البشرية السرة الحبال، وديفيد يورجنسن لمساعدة مع الثقافات كوتشلياي.
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
Referências
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
- LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
- Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
- Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
- Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
- Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
- Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere’s disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
- House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
- Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
- Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
- Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
- Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
- Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
- Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
- Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton’s Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
- Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton’s jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
- Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton’s Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
- Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
- Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
- Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).
