भीतरी कान ऊतक इंजीनियरिंग के लिए Decellularizing माउस Cochleae के लिए एक प्रोटोकॉल
Summary
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए पाड़ के रूप में उपयोग के लिए decellularize और decalcify माउस cochleae के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदर्शित करने के लिए है ।
Abstract
स्तनधारियों में, mechanosensory बाल कोशिकाओं है कि सुनवाई कमी को पुनर्जीवित करने की क्षमता की सुविधा है, जो सुनवाई हानि के लिए उपचार सीमित है । वर्तमान अपक्षयी दवा रणनीतियों स्टेम सेल या भीतरी कान में आसपास के समर्थन कोशिकाओं के आनुवंशिक हेरफेर प्रत्यारोपण पर ध्यान केंद्रित किया है क्षतिग्रस्त स्टेम कोशिकाओं के प्रतिस्थापन को सही करने के लिए सुनवाई नुकसान को प्रोत्साहित करने के लिए । फिर भी, extracellular मैट्रिक्स (ECM) उत्प्रेरण और बाल कोशिकाओं के समारोह को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं, और अच्छी तरह से जांच नहीं की गई है । एक पाड़ वयस्क स्टेम सेल के रूप में कॉकलियर ECM का प्रयोग कैसे संरचना और extracellular पर्यावरण एड्स कोशिकाओं की वास्तुकला सुनवाई समारोह बनाए रखने में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । यहाँ हम अलग और decellularizing cochleae चूहों से perfused वयस्क स्टेम कोशिकाओं को स्वीकार मचान के रूप में उपयोग करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. वर्तमान प्रोटोकॉल में, cochleae euthanized चूहों, सेलुलर, और decalcified से अलग कर रहे हैं । इसके बाद, मानव व्हार्टन जेली कोशिकाओं (hWJCs) है कि गर्भनाल से अलग थे ध्यान से प्रत्येक कोक्लीअ में perfused थे । cochleae के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए प्रसंस्करण के दौर से गुजर से पहले 30 दिनों के लिए संस्कृति थे । सेलुलर cochleae पहचाने extracellular संरचनाओं को बनाए रखा, लेकिन कोशिकाओं या डीएनए की नजर टुकड़े की उपस्थिति प्रकट नहीं किया । कोक्लीअ में perfused कोशिकाओं इंटीरियर और कोक्लीअ के बाहरी के सबसे पर आक्रमण किया और 30 दिनों की अवधि में घटना के बिना बढ़ी । इस प्रकार, वर्तमान पद्धति का अध्ययन कैसे कॉकलियर ECM कोशिका विकास और व्यवहार को प्रभावित करता है इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
कोक्लीअ एक जटिल सर्पिल संरचना लौकिक हड्डी में पाया जाता है । यह एक बाहरी बोनी भूलभुलैया और एक गाढ़ा, इनर झिल्लीदार भूलभुलैया1से बना है । झिल्लीदार भूलभुलैया तीन द्रव रिक्त स्थान होते हैं: Scala vestibuli, Scala मीडिया, और Scala tympani1। scala मीडिया संवेदी उपकला, जो कोशिका प्रकार के एक भीड़ से बना है घरों, लेकिन संवेदी बाल कोशिकाओं (एचसी), जो तंत्रिका आवेगों को ध्वनि तरंगों में यांत्रिक ऊर्जा transduce2, विशेष रुचि के हैं. ध्वनिक आघात करने के लिए जोखिम3,4,5, दवा6, रोग7,8, और उंर बढ़ने9 सब एचसी मौत के माध्यम से बिगड़ा श्रवण समारोह में परिणाम कर सकते हैं । स्तनधारियों में बाल कोशिका हानि, एवियन HCs, जो चोट के बाद पुनर्जीवित कर सकते है के विपरीत स्थाई है10।
समकालीन अनुसंधान के प्रयासों की एक किस्म के लिए खो HCs बहाल की मांग की है, हालांकि विशिष्ट प्रयोगात्मक दृष्टिकोण बदलती हैं । संवेदी उपकला में जीन अभिव्यक्ति की हेरफेर और शरीर के बाहर विभेदित स्टेम कोशिकाओं के आरोपण क्षेत्र में प्रमुख दृष्टिकोण हैं, हालांकि प्रेरण तरीकों कि कॉकलियर organoids में स्टेम कोशिकाओं अंतर करना चाहते हैं 11,12,13का प्रयास किया । इन तरीकों में से प्रत्येक या तो स्टेम सेल, या विकासात्मक cues स्टेम सेल द्वारा इस्तेमाल पर सीधे निर्भर है; हालांकि, एक दूसरे साझा, और संभावित महत्वपूर्ण, तत्व कोक्लीअ ही14,15के ECM है ।
ECM न केवल कोशिकाओं और ऊतक है, जो सेल आसंजन, प्रसार, अस्तित्व, और प्रवास के लिए एक सतह भी शामिल है के लिए शारीरिक सहायता प्रदान करता है, लेकिन HCs के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और सर्पिल नाड़ीग्रंथि15,16 ,17. स्वाभाविक रूप से होने वाली ECM आगमनात्मक संकेत है कि सेल phenotype निर्धारण और/या सेल आसंजन, प्रसार, और अस्तित्व18गाइड कर सकते है प्रदान करता है । नतीजतन, प्रसंस्कृत hWJCs के साथ संयोजन में कोक्लीअ के उपयोग के लिए एक अनूठा ECM और एचसी उत्थान की भूमिका का पता लगाने का अवसर प्रदान करते हैं । HWJCs एक आसानी से उपलब्ध हैं, गैर विवादास्पद कोशिका मानव गर्भनाल कि mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के19तरह व्यवहार से पृथक प्रकार । HWJCs को नीचे neurosensory कोशिका वंश20,21अंतर करने की क्षमता दिखाई है । इस प्रकार, वर्तमान प्रोटोकॉल अलगाव, decellularization विवरण, और भीतरी कान ऊतक इंजीनियरिंग के लिए hWJCs के साथ C57BL माउस लावे से cochleae के छिड़काव ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम सफलतापूर्वक दिखा दिया है कि देशी कॉकलियर कोशिकाओं कोक्लीअ से एक decellularization प्रक्रिया है, जो एक जटिल, तीन आयामी ऊतक पाड़ के रूप में कोक्लीअ के उपयोग के लिए अनुमति देता है के माध्यम से हटाया जा सकता है । संत?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
मौजूदा परियोजना अवधारणा कोष के कैनसस सबूत के विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया । हम मानव गर्भनाल प्राप्त करने में हमें सहायता के लिए KUMC (कैनसस सिटी, एस) में नर्सिंग स्टाफ का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और cochleae संस्कृतियों के साथ सहायता के लिए डेविड Jorgensen ।
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
Referências
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