Ett protokoll för Decellularizing mus Cochleae för innerörat Tissue Engineering
Summary
Målet med detta protokoll är att demonstrera en effektiv metod för att decellularize och om avkalkning mus cochleae för utnyttjande som ställningar för tissue engineering program.
Abstract
Hos däggdjur, mechanosensory hårcellerna som underlättar förhandlingen saknar förmågan att regenerera, som har begränsad behandlingar för hörselnedsättning. Nuvarande strategier för regenerativ medicin har fokuserat på transplantation av stamceller eller genetisk manipulation av omgivande stödjeceller i innerörat att uppmuntra utbyte av skadade stamceller att korrigera hörselnedsättning. Men den extracellulär matrixen (ECM) kan spela en viktig roll i inducerande och upprätthålla funktion av hårceller, och har inte undersökts väl. Med hjälp av cochlear kan ECM som en byggnadsställning växa adulta stamceller ge unika insikter i hur sammansättning och arkitekturen av den extracellulära miljön hjälper celler upprätthålla förhandlingen funktion. Här presenterar vi en metod för att isolera och decellularizing cochleae från möss att använda som ställningar att acceptera perfunderade adulta stamceller. I det nuvarande protokollet isoleras cochleae från euthanized möss, cell-lösa och urkalkade permanenta. Efteråt, var mänskliga Wharton’s jelly celler (hWJCs) som var isolerade från navelsträngen noggrant perfusion in varje cochlean. Cochleae användes som bioreaktorer och celler odlades i 30 dagar innan de genomgick behandling för analys. Cell-lösa cochleae behöll identifierbar extracellulära strukturer, men avslöja inte förekomsten av celler eller märkbar fragment av DNA. Celler perfusion in i cochlean invaderade de flesta av interiör och exteriör av cochlean och växte utan incidenter under en löptid på 30 dagar. Dagskursmetoden kan således användas för att studera hur cochlear ECM påverkar cell utveckling och beteende.
Introduction
Snäckan är en intrikat spiralstrukturen Funna i tinningbenet. Den består av en yttre benig labyrint och en koncentrisk, inre membranös labyrint1. Membranös labyrinten består av tre flytande utrymmen: Scala vestibuli, Scala media och Scala tympani1. Scala media hus sensoriska epitelet, som består av en mängd celltyper, men sensoriska hårcellerna (HC), som transduce mekanisk energi i ljudvågor till nervimpulser2, är av särskilt intresse. Exponering för akustisk trauma3,4,5, medicinering6, sjukdom7,8och åldrande9 kan alla leda till nedsatt hörsel funktion via HC död. Hår cellförlust hos däggdjur är permanent, till skillnad från aviär HCs, som kan regenerera efter skada10.
En mängd samtida forskningsansträngningar har försökt att återställa förlorade HCs, även om de specifika experimentella metoderna varierar. Manipulation av genuttryck i sensoriska epitelet och implantation av stamcellerna differentierade utanför kroppen är dominerande ansatser inom, men induktion metoder som syftar till att differentiera stamceller till cochlear organoids har varit försökt11,12,13. Alla dessa metoder är antingen direkt beroende av stamceller eller utvecklingsmässiga ledtrådar används av stamceller; dock en andra delade, och potentiellt kritiska, elementet är ECM av snäckan själv14,15.
ECM ger inte bara fysiska stöd för celler och vävnad, som omfattar en yta för celladhesion, spridning, överlevnad och migration, men också spelar avgörande roller i utvecklingen av HCs och spiral ganglion15,16 ,17. Naturligt ger förekommande ECM induktiva signaler som kan vägleda cell fenotyp bestämning eller cell adhesion, spridning och överlevnad18. Därför, användningen av cell-lösa snäckan i kombination med odlade hWJCs erbjuder en unik möjlighet att utforska rollen av ECM och HC regeneration. HWJCs är en lättillgänglig, icke-kontroversiella celltyp som isolerats från mänskliga navelsträngar som beter sig som mesenkymala stamceller19. HWJCs har visat förmågan att skilja ned sensorineural cell härstamningar20,21. Således, det nuvarande protokollet uppgifter om isolering, decellularization och genomblödning av cochleae från C57BL mus slaktkroppar med hWJCs för innerörat vävnadsteknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har framgångsrikt visat att infödda cochlear celler kan tas bort från snäckan via en decellularization process, vilket möjliggör användning av snäckan som en intrikat, tredimensionella vävnad byggnadsställning. Santi et al. 15 utvecklade den första metoden för decellularizing cochleae, och har korrekt uppskattade volymerna för många cochlear strukturer genom med hjälp av lätta blad mikroskopi23. Sådana tidiga arbete fungerat som en stark grund f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det aktuella projektet finansierades av University of Kansas bevis på konceptet fonden. Vi vill tacka vårdpersonalen på KUMC (Kansas City, KS) för att hjälpa oss att få mänskliga navelsträngar, och David Jorgensen bistå med cochleae kulturer.
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
Referências
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
- LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
- Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
- Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
- Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
- Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
- Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere’s disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
- House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
- Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
- Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
- Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
- Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
- Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
- Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
- Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton’s Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
- Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton’s jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
- Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton’s Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
- Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
- Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
- Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).
