En protokol til Decellularizing musen Cochleae for indre øre vævsmanipulering
Summary
Målet med denne protokol er at påvise en effektiv metode til at decellularize og afkalke mus cochleae for udnyttelse som stilladser for væv ingeniørmæssige anvendelser.
Abstract
I pattedyr, mechanosensory hårceller, der letter hørelse manglende evne til at regenerere, som har begrænset behandlinger for høretab. Nuværende regenerativ medicin strategier har fokuseret på transplantere stamceller eller genetisk manipulation af omgivende støtte celler i det indre øre til at tilskynde til udskiftning af beskadigede stamceller til at afhjælpe tab af hørelse. Endnu, den ekstracellulære matrix (ECM) kan spille en afgørende rolle i overtalelse og bevare funktion af hårcellerne, og er ikke blevet godt undersøgt. Ved hjælp af cochlear kan ECM som et stillads at dyrke voksne stamceller give unikt indblik i hvordan sammensætning og arkitekturen i det ekstracellulære miljø aids celler med at opretholde hørelse funktion. Her vil vi præsentere en metode til at isolere og decellularizing cochleae fra mus til brug som stilladser accepterer perfunderet voksne stamceller. I den nuværende protokol er cochleae isoleret fra aflivede mus, decellularized, og kalkfattige. Bagefter, blev menneskelige Wharton’s jelly celler (hWJCs), der blev isoleret fra navlestrengen omhyggeligt perfunderet ind hver cochlea. Cochleae blev brugt som bioreaktorer, og celler blev kulturperler i 30 dage før det gennemgår behandling for analyse. Decellularized cochleae beholdt identificerbare ekstracellulære strukturer, men afsløre ikke tilstedeværelsen af celler eller mærkbar fragmenter af DNA. Celler perfunderet ind i cochlea invaderede de fleste af de indvendige og udvendige af cochlea og voksede uden uheld over en varighed af 30 dage. Således er kan den nuværende metode bruges til at studere hvordan cochlear ECM påvirker celle udvikling og adfærd.
Introduction
Cochlea er en indviklet spiralstrukturen i den tidsmæssige knoglen. Det består af en ydre knoklet labyrint og en koncentrisk, indre membranøs labyrint1. Membranøs labyrint består af tre væske rum: Scala vestibuli, Scala medier og Scala tympani1. Scala media huser den sensoriske epitel, der består af en lang række celletyper, men de sensoriske hår celler (HC), som transduce mekanisk energi i lydbølger til nerveimpulser2, er af særlig interesse. Udsat for støjskader3,4,5, medicin6, sygdom7,8, og aging9 kan alle resultere i nedsat auditive funktion via HC død. Hår celletab i pattedyr er permanent, i modsætning til aviær HCs, der kan regenerere efter skade10.
En bred vifte af moderne forskningsindsats har forsøgt at gendanne tabte HCs, selv om de specifikke eksperimentelle metoder varierer. Manipulation af genekspression i sensoriske epitel og implantation af stamceller differentieret uden for kroppen er dominerende tilgange i feltet, selv om induktion metoder, der søger at differentiere stamceller i cochlear organoids har været forsøgt11,12,13. Hver af disse metoder er enten direkte afhængige stamceller, eller de udviklingsmæssige cues bruges af stamceller; dog en anden delt, og potentielt kritiske element er ECM af øresneglen selv14,15.
ECM giver ikke kun fysiske support for celler og væv, som omfatter en overflade til celle vedhæftning, spredning, overlevelse og migration, men også spiller afgørende roller i udviklingen af HCs og spiral ganglion15,16 ,17. Naturligt indeholder forekommende ECM induktive signaler, der kan guide celle fænotype bestemmelse og/eller celle vedhæftning, spredning og overlevelse18. Derfor brugen af decellularized cochlea i kombination med kulturperler hWJCs tilbyder en unik mulighed for at udforske rollen af ECM og HC regenerering. HWJCs er en let tilgængelige, ikke-kontroversielle celletype isoleret fra menneskelige umbilical snore, der opfører sig som mesenkymale stamceller19. HWJCs har vist evnen til at skelne ned neurosensory celle lineages20,21. Således, den aktuelle protokol detaljer isolering, decellularization og perfusion af cochleae fra C57BL mus slagtekroppe med hWJCs for indre øre vævsmanipulering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har med succes demonstreret, at indfødte cochlear celler kan blive fjernet fra cochlea via en decellularization proces, som giver mulighed for brug af øresneglen som en indviklet, tre-dimensionelle væv stillads. Santi mfl. 15 udviklet den oprindelige metode til decellularizing cochleae, og har præcist anslåede mængder af mange cochlear strukturer gennem ved hjælp af lys ark mikroskopi23. Disse tidlige arbejde fungerede som et stærkt grundlag for vævstek…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det aktuelle projekt blev finansieret af University of Kansas bevis for konceptet fond. Vi vil gerne takke plejepersonalet på KUMC (Kansas City, KS) for at hjælpe os med at opnå menneskelige umbilical snore og David Jørgensen bistå med cochleae kulturer.
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
Referências
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
- LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
- Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
- Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
- Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
- Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
- Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere’s disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
- House, J. W., Brackmann, D. E. Tinnitus: surgical treatment. Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
- Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
- Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
- Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
- Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
- Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
- Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
- Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton’s Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
- Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton’s jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
- Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton’s Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
- Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
- Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
- Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).
