Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno
Summary
L’obiettivo del presente protocollo è di dimostrare un metodo efficace per decellularize e decalcificare coclee del mouse per l’utilizzo come scaffold per applicazioni di ingegneria dei tessuti.
Abstract
Nei mammiferi, le cellule ciliate che mechanosensory che facilitano la mancanza dell’udito la capacità di rigenerare, che ha limitato i trattamenti per la perdita dell’udito. Attuali strategie di medicina rigenerativa sono concentrati sul trapianto di cellule staminali o la manipolazione genetica delle cellule di supporto nell’orecchio interno per incoraggiare la sostituzione delle cellule danneggiate di staminali per correggere la perdita della capacità uditiva circostanti. Ancora, la matrice extracellulare (ECM) può svolgere un ruolo vitale nell’induzione e mantenimento della funzione delle cellule ciliate e non è stato ben studiata. Utilizzando il cocleare ECM come impalcatura per crescere le cellule staminali adulte possono fornire intuizioni uniche come la composizione e l’architettura dell’ambiente extracellulare aiuta le cellule nel sostenere la funzione uditiva. Qui presentiamo un metodo per isolare e decellularizing coclee da topi da utilizzare come scaffold accettando irrorato le cellule staminali adulte. Nel protocollo attuale, coclee sono isolate da topi eutanasizzati, decellularized e decalcificati. In seguito, cellule di gelatina di Wharton umana (hWJCs) che sono state isolate da cordone ombelicale sono state irrorate con attenzione in ogni coclea. Le coclee sono stati usati come bioreattori, e le cellule sono state coltivate per 30 giorni prima in fase di elaborazione per l’analisi. Coclee decellularizzati mantenuto strutture extracellulari identificabili, ma non hanno rivelato la presenza di cellule o notevoli frammenti di DNA. Cellule irrorate nella coclea invasero la maggior parte dell’interno ed esterno della coclea ed è cresciuta senza incidenti nel corso di una durata di 30 giorni. Così, il metodo corrente può essere utilizzato per studiare come cocleare ECM colpisce cellule sviluppo e comportamento.
Introduction
La coclea è una struttura a spirale intricato trovata nell’osso temporale. Esso è composto da un labirinto osseo esterno e un labirinto membranoso concentrici, interno1. Il labirinto membranoso è costituito da tre spazi fluidi: vestibuli di scala, Scala media e tympani di Scala1. I mezzi di scala ospita l’epitelio sensoriale, che è composto da una moltitudine di tipi di cellule, ma le cellule ciliate sensoriali (HC), che trasducono energia meccanica in onde sonore in impulsi nervosi2, sono di particolare interesse. L’esposizione al trauma acustico3,4,5, farmaco6, malattia7,8e9 di invecchiamento può provocare di alterata funzione uditiva tramite morte HC. Perdita di capelli cellulare nei mammiferi è permanente, a differenza di aviaria HCs, che può rigenerare dopo lesioni10.
Una varietà di sforzi di ricerca contemporanea hanno cercato di ripristinare perso HCs, anche se gli approcci sperimentali specifici variano. Manipolazione dell’espressione genica in epitelio sensoriale e l’impianto di cellule staminali differenziate all’esterno del corpo sono approcci dominanti nel campo, anche se i metodi di induzione che cercano di differenziare le cellule staminali in organoids cocleari sono stati ha tentato di11,12,13. Ciascuno di questi approcci sia reliant direttamente su cellule staminali, o i segnali dello sviluppo utilizzati dalle cellule staminali; Tuttavia, un secondo ha condiviso, e potenzialmente critici, elemento è l’ECM della coclea stessa14,15.
L’ECM non solo fornisce supporto fisico per cellule e tessuti, che comprende una superficie di adesione delle cellule, proliferazione, sopravvivenza e migrazione, ma svolge anche il ruolo critico nello sviluppo di HCs e la spirale del ganglio15,16 ,17. Naturalmente che si verificano ECM fornisce segnali induttivi che possono guidare la determinazione del fenotipo cellulare e/o di adesione, proliferazione e sopravvivenza cellulare18. Di conseguenza, l’uso di decellularizzazione coclea in combinazione con hWJCs coltivate offrono un’occasione unica per esplorare il ruolo della rigenerazione ECM e HC. HWJCs sono un tipo di cellula prontamente disponibili, non controverso isolato dal cordone ombelicale umani che si comportano come cellule staminali mesenchimali19. HWJCs hanno dimostrato la capacità di differenziarsi verso il basso delle cellule neurosensoriali lignaggi20,21. Così, l’attuale protocollo dettagli l’isolamento, decellularizzazione e perfusione delle coclee da carcasse del mouse C57BL con hWJCs per l’ingegneria dei tessuti dell’orecchio interno.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo dimostrato con successo che le cellule cocleari native possono essere rimosso dalla coclea tramite un processo di decellularizzazione, che consente l’utilizzo della coclea come un’impalcatura di tessuto intricato, tridimensionale. Santi et al. 15 ha sviluppato il metodo iniziale per coclee decellularizing e hanno valutato esattamente i volumi di molte strutture cocleari attraverso con l’aiuto del foglio leggero microscopia23. Questi primi lavori servito com…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’attuale progetto è stato finanziato dalla prova dell’Università del Kansas di fondo di concetto. Vorremmo ringraziare il personale infermieristico a KUMC (Kansas City, KS) per aiutarci a ottenere cordoni ombelicali umani e David Jorgensen per assistere con culture di coclee.
Materials
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
Referências
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