Um protocolo para a síntese, purificação e caracterização de um inibidor de rutênio-baseado da absorção de cálcio mitocondrial é apresentado. Um procedimento para avaliar a sua eficácia em células de mamíferos permeabilized é demonstrado.
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Artigo de método
Síntese e avaliação de um inibidor de absorção de cálcio mitocondrial rutênio-baseado
Neste artigo
Resumo
Resumo
Detalhamos a síntese e purificação de um inibidor de absorção cálcio mitocondrial,5 +[(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]. A síntese otimizada deste composto começa de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 em 1 M NH4OH em um recipiente fechado, produzindo uma solução verde. Purificação é realizada com a cromatografia de permuta catiónica. Este composto é caracterizado e verificado ser puro por espectroscopia UV-vis e IR. As propriedades inibitório de absorção de cálcio mitocondrial são avaliadas em pilhas HeLa permeabilized por espectroscopia de fluorescência.
Introdução
Cálcio mitocondrial é um regulador chave para um número de processos que são críticos para a função celular normal, incluindo apoptose e produção de energia. 1 , 2 , 3 o uniporter cálcio mitocondrial (MCU), uma proteína de transporte de íon que reside na membrana mitocondrial interna, regula o influxo de íons cálcio na mitocôndria. 4 , 5 , 6 químicos inibidores do MCU são ferramentas valiosas para continuar os esforços para estudar a função e funções celulares deste transporte de pro....
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Protocolo
Nota: ácidos concentrados e bases são usadas nesta síntese. Usar todas as práticas de segurança adequadas ao realizar a reação, incluindo o uso de controles de engenharia (coifa) e equipamentos de proteção individual (EPI) incluindo óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida e sapatos fechados.
1. preparação de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
- síntese de [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12
- dissolver 1,00 g de RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru por peso, 4,1 ....
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Resultados
Este método descreve uma síntese do cálcio mitocondrial absorção inibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 a partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, um matérias-primas ruthenium(III) conhecidos. [Ru (NH3)5Cl] CL2 caracteriza-se por espectroscopia de IR, com modos vibracionais em 3200 cm-1, cm 1608-1, 1298 cm-1e 798 cm.......
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Discussão
O cálcio mitocondrial absorção inibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 pode ser sintetizada de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, um ruthenium(III) bem conhecido começando o material, conforme descrito neste procedimento. A síntese de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 é facilmente alcançada com pouca dificuldade. Após agitação RuCl3 para 16 h na hidrazina hidrato, o pH da solução deve ser a.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pela Universidade de Cornell. Este trabalho fez uso do centro Cornell para materiais compartilhados instalações de pesquisa, que são suportados pelo programa NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconhece apoio por uma bolsa de pesquisa da pós-graduação NSF (Grant DGE - 1650441) e Dr. Dave Holowka para assistência com os experimentos de cálcio. Qualquer opinião, conclusões e conclusões ou recomendações expressadas neste material são as dos autores (s) e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Hidrato de tricloreto de rutênio | Pressão Química | 3750 | |
| Ácido clorídrico concentrado | J.T. Baker | 9535 | |
| Hidróxido de amônio concentrado | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Cálcio Verde 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Succinato de Sódio | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glicose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Balão de fundo redondo | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Rolha de vidro | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| Coluna de vidro de 10 mm x 15 cm com reservatórios | Personalizado - semelhante às colunas Chemglass | Semelhante a CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Tubos Falcon de fundo redondo | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| Placas de Petri de 500 cm2 | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | de 15250061 | Científico ThermoFisher | |
| Aldrich | Z359629 | ||
| Cuvetes de Acrílico | VWR | 58017-875 | |
| Espectrômetro UV-Vis | Agilent Modelo Cary 8454 | ||
| Espectrofluorímetro | SLM Modelo 8100C | ||
| Espectrômetro IR | Bruker Hyprion FTIR com anexo | ||
| Centrífuga | ALC Modelo PM140R | ||
| Microscópio de luz invertida | VWR | 89404-462 |
Referências
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
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Reimpressões e permissões
