Synthèse et évaluation d’un inhibiteur de l’absorption de Calcium mitochondrique axée sur le ruthénium
Summary
Un protocole pour la synthèse, purification et caractérisation d’un inhibiteur de ruthénium-basée de la capture de calcium mitochondrique est présenté. Une procédure pour évaluer son efficacité dans les cellules de mammifères perméabilisées est démontrée.
Abstract
Nous détaillons la synthèse et la purification d’un inhibiteur de l’absorption de calcium mitochondrique, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]5 +. La synthèse optimisée de ce composé commence à partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 en 1 M NH4OH dans un récipient fermé, ce qui donne une solution verte. Purification s’effectue par chromatographie échangeuse de cations. Ce composé est caractérisé et vérifié comme pure par spectroscopie UV-visible et IR. Les propriétés inhibitrices de l’absorption de calcium mitochondrique sont évaluées dans les cellules HeLa perméabilisées par spectroscopie de fluorescence.
Introduction
Le calcium mitochondrique est un régulateur clé pour un certain nombre de processus qui sont essentielles à la fonction des cellules normales, y compris la production d’énergie et de l’apoptose. 1 , 2 , 3 le calcium mitochondrique Uniport (MCU), une protéine de transport des ions qui se trouve dans la membrane mitochondriale interne, réglemente l’influx des ions calcium dans les mitochondries. 4 , 5 , 6 les inhibiteurs chimiques de la MCU sont des outils précieux pour la poursuite des efforts pour étudier la fonction et les rôles cellulaires de ce transport des protéines et le calcium mitochondrique. Le composé [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, est un des seuls inhibiteurs sélectifs connus pour le MCU avec une valeur déclarée ded K de 24 µM.7 ,8,9,10 , ce complexe est une impureté commune trouvée dans les formulations commerciales de rouge de ruthénium (RuRed), un triruthenium di-µ-oxo ponté hexacation de la formule [(NH3) 5 RU (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, qui a également été utilisé comme un inhibiteur de l’absorption du calcium. Ru360 est disponible dans le commerce, mais il est très coûteux. En outre, la synthèse et l’isolement des Ru360 est contestée par les procédures de purification difficile et méthodes de caractérisation ambiguë.
Nous avons récemment rapporté les procédures alternatives pour accéder à un Ru360 analogique, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 ce composé inhibe la MCU avec l’affinité élevée, similaire à Ru360. Dans ce protocole, nous décrirons notre synthèse plus efficace de ce composé, qui commence à partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purification du produit à l’aide de résine échangeuse de cations fortement acide est détaillée, ainsi que les pièges communs pour cette procédure. Aussi, nous présentons des méthodes de caractérisation et d’évaluation de pureté composée et délimiter une approche simple pour tester son efficacité en bloquant l’absorption calcique mitochondriale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le calcium mitochondrial absorption inhibiteur [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 peut être synthétisé de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un bien connu ruthénium à partir de matériel, tel que décrit dans cette procédure. La synthèse de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 est facilement atteint sans trop de difficulté. Après agitation RuCl3 pendant 16 h dans l’hydrazine hydrate, l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par l’Université Cornell. Ce travail fait usage du centre Cornell pour matériaux recherche Shared Facilities, qui sont pris en charge par le programme NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconnaît la prise en charge par une bourse de recherche universitaire de la NSF (subvention DGE – 1650441) et Dr. Dave Holowka d’assistance avec les expériences de calcium. Opinions, résultats et conclusions ou recommandations exprimées dans ce matériel sont celles de l’auteur (s) et ne reflètent pas nécessairement les vues de la National Science Foundation.
Materials
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom – similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
Referências
- De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Giorgi, C., et al. Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine. Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).
- De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).
- Baughman, J. M., et al. Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).
- Kamer, K. J., Mootha, V. K. The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).
- Ying, W. -. L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex. Bioquímica. 30 (20), 4949-4952 (1991).
- Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -. L., Sanadi, D. R. The component of “ruthenium red” responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3. J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).
- Matlib, M. A., et al. Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes. J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).
- Oxenoid, K., et al. Architecture of the mitochondrial calcium uniporter. Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).
- Nathan, S. R., et al. Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake. Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).
- Allen, A. D., Senoff, C. V. Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III). Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Deak, A. T., et al. Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake. Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).
