Method Article

Síntese e avaliação de um inibidor de absorção de cálcio mitocondrial rutênio-baseado

DOI:

10.3791/56527

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October 26th, 2017

 , 
1Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University

In This Article

Summary

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Um protocolo para a síntese, purificação e caracterização de um inibidor de rutênio-baseado da absorção de cálcio mitocondrial é apresentado. Um procedimento para avaliar a sua eficácia em células de mamíferos permeabilized é demonstrado.

Abstract

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Detalhamos a síntese e purificação de um inibidor de absorção cálcio mitocondrial,5 +[(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)]. A síntese otimizada deste composto começa de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 em 1 M NH4OH em um recipiente fechado, produzindo uma solução verde. Purificação é realizada com a cromatografia de permuta catiónica. Este composto é caracterizado e verificado ser puro por espectroscopia UV-vis e IR. As propriedades inibitório de absorção de cálcio mitocondrial são avaliadas em pilhas HeLa permeabilized por espectroscopia de fluorescência.

Introduction

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Cálcio mitocondrial é um regulador chave para um número de processos que são críticos para a função celular normal, incluindo apoptose e produção de energia. 1 , 2 , 3 o uniporter cálcio mitocondrial (MCU), uma proteína de transporte de íon que reside na membrana mitocondrial interna, regula o influxo de íons cálcio na mitocôndria. 4 , 5 , 6 químicos inibidores do MCU são ferramentas valiosas para continuar os esforços para estudar a função e funções celulares deste transporte de pro....

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Protocol

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Nota: ácidos concentrados e bases são usadas nesta síntese. Usar todas as práticas de segurança adequadas ao realizar a reação, incluindo o uso de controles de engenharia (coifa) e equipamentos de proteção individual (EPI) incluindo óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida e sapatos fechados.

1. preparação de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (µ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5

  1. síntese de [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12
    1. dissolver 1,00 g de RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru por peso, 4,1 ....

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Results

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Este método descreve uma síntese do cálcio mitocondrial absorção inibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 a partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, um matérias-primas ruthenium(III) conhecidos. [Ru (NH3)5Cl] CL2 caracteriza-se por espectroscopia de IR, com modos vibracionais em 3200 cm-1, cm 1608-1, 1298 cm-1e 798 cm.......

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Discussion

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O cálcio mitocondrial absorção inibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (µ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 pode ser sintetizada de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, um ruthenium(III) bem conhecido começando o material, conforme descrito neste procedimento. A síntese de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 é facilmente alcançada com pouca dificuldade. Após agitação RuCl3 para 16 h na hidrazina hidrato, o pH da solução deve ser a.......

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Disclosures

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Os autores não têm nada a divulgar

Acknowledgements

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Esta pesquisa foi apoiada pela Universidade de Cornell. Este trabalho fez uso do centro Cornell para materiais compartilhados instalações de pesquisa, que são suportados pelo programa NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconhece apoio por uma bolsa de pesquisa da pós-graduação NSF (Grant DGE - 1650441) e Dr. Dave Holowka para assistência com os experimentos de cálcio. Qualquer opinião, conclusões e conclusões ou recomendações expressadas neste material são as dos autores (s) e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Hidrato de tricloreto de rutênioPressão Química3750
Ácido clorídrico concentradoJ.T. Baker9535
Hidróxido de amônio concentradoMallinckrodt Chemical WorksA669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 MeshAlfa Aesar13945
Cálcio Verde 5NInvitrogenC3737
DigitoninAldrich260746
DMSOAldrich471267
EGTAAldrichE3889
KClUSB20598
KH2PO4AldrichP3786
MgCl2Fisher ScientificM33-500
HEPESFluka54466
Succinato de SódioAlfa Aesar33386
EDTAJ.T. Baker8993-01
GlicoseAldrichG5000
200 Balão de fundo redondoChemGlassCG-1506-14
Rolha de vidroChemGlassCG-3000-05
Coluna de vidro de 10 mm x 15 cm com reservatóriosPersonalizado - semelhante às colunas ChemglassSemelhante a CG-1203-20
DMEMCorning10-017-CV
FBSGibco10437028
PBSCorning21-040-CV
Tubos Falcon de fundo redondoFisher Scientific14-959-11B 
Placas de Petri de 500 cm2Corning431110
Trypan bluede 15250061Científico ThermoFisher
AldrichZ359629
Cuvetes de AcrílicoVWR 58017-875
Espectrômetro UV-VisAgilent Modelo Cary 8454 
EspectrofluorímetroSLM Modelo 8100C
Espectrômetro IRBruker Hyprion FTIR com anexo
CentrífugaALC Modelo PM140R
Microscópio de luz invertidaVWR 89404-462
Hemacitômetro ATR

References

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  1. De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth. Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).
  2. Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: the calcium connection. Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).

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Ruthenium 360 AnalogMitochondrial Calcium UptakeCation Exchange ChromatographyUV Vis SpectroscopyIR SpectroscopyFluorescence SpectroscopyPermeabilized HeLa CellsRuthenium Brown ImpuritiesGreen Brown FractionsAmmonium Hydroxide Synthesis

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