Método baseado na precipitação de Formazan induzida pela exposição à luz azul de coloração de DNA

Summary

Este método permite coloração seletiva e quantificação de DNA em géis embebendo o gel em um SYBR Green eu / Nitro azul tetrazólio solução e então exposto à luz solar ou uma fonte de luz azul. Isto produz um precipitado visível e não requer quase nenhum equipamento, tornando-a ideal para uso em campo.

Abstract

Métodos de coloração de DNA são muito importantes para a investigação biomédica. Nós projetamos um método simples que permite a visualização de DNA a olho nu, a formação de um precipitado colorido. Ele funciona através da imersão a acrilamida ou gel de agarose DNA em uma solução de 1 x (equivalente a 2,0 µM) SYBR Green eu (SG eu) e 0,20 mM nitro azul tetrazólio que produz um roxo precipitado de formazan quando expostos à luz solar ou especificamente a luz azul. Também, testes de recuperação de DNA foram realizados utilizando um plasmídeo resistente à ampicilina em um gel de agarose corado com nosso método. Obteve-se um maior número de colônias com nosso método do que com a tradicional mancha usando SG eu com iluminação ultravioleta. O método descrito é rápido, específico e não-tóxico para a deteção de DNA, permitindo a visualização de biomoléculas a "olho nu", sem um transiluminador e é barato e apropriado para uso em campo. Por estas razões, o nosso DNA novo método de coloração tem potenciais benefícios para a investigação e a indústria.

Introduction

Com os avanços em bioquímica e biologia molecular, os estudos envolvendo DNA exigiram melhores técnicas para analisar o DNA. O primeiro método para coloração de DNA foi prata coloração, que é muito sensível, mas carece de seletividade e não permite a recuperação de amostra. Mais tarde, o desenvolvimento de coloração fluorescente de DNA permitiu a seletiva quantificação de DNA com a possibilidade de recuperação da amostra. Dentre os corantes fluorescentes primeiros usados para quantificação de DNA foi de brometo de etídio¹, que é mutagênico². No entanto, agora existem corantes fluorescentes melhorados mais seguros e mais ....

Protocol

1. preparação e execução do Gel

1. Prepare o desnaturação não 12% gel de polyacrylamide gel usando a receita de sódio Dodecil sulfato de sódio-Polyacrylamide Gel eletroforese (SDS-PAGE) encontrados em Sapeka e Russell¹⁴ mas usando água em vez de SDS.
   1. Para preparar a 5 mL de solução de gel, use 1,7 mL de água destilada, 2 mL de acrilamida/bis acrilamida (30/0,8% p/v), 1,3 mL de 1,5 M Tris pH 8,8, 0,05 mL de persulfato de amónio de 10% e 0,002 mL de TEMED.
   2. Para preparar 2 mL de gel de empilhamento usar 1,5 mL de água, 0,33 mL de acrilamida/bis acrilamida (30/0,8% p/v), 0,25 mL de 1 M Tris pH 6,8, 0,02 mL de persulfato de....

Results

Um precipitado de formazan roxo aparece onde se encontra o DNA (verificado por espectrometria de massa¹³). No experimento, uma escada de DNA foi carregada para fazer uma curva de calibração (Figura 3). O protocolo funciona para gel de agarose e acrilamida, mas tem uma menor intensidade e leva mais tempo em agarose. No entanto, o uso de géis de agarose permite a recuperação da amostra usando um kit disponível comercialmente, e não inter.......

Discussion

Um sensível e romance método de coloração de DNA com base na redução do NBT e o uso do SG, que foi apresentado neste artigo. O passo crítico neste protocolo é o tempo de incubação do gel em NBT-SG eu solução e a concentração de NBT. O tempo de coloração para gel de agarose é maior que para géis de acrilamida por causa da maior espessura de gel de agarose. Esse método não funciona bem na presença de SDS como NBT precipita-se em contacto com ele. Se o gel Obtém um fundo roxo, recomendamos que o gel de outro ser preparado e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente azul nitro da	298-83-9	do ouro	usado na mancha
Reagente verde I 10000X de SYBR	Thermo-Fisher	S7563	usado na coloração
Kit de extração de gel	QIAGEN	28704	usado para extrair o plasmídeo do gel na escada de DNA do ensaio de integridade
	Thermo-Fisher	SM 1331	usado para fazer curvas de calibração e como referência para cortar banda em ensaio de integridade
Ágar Ágar	Merck		usado para fazer placas de cultura de LB-ampicilina
cloreto de sódio	Merck	1064045000	usado para fazer placas de cultura LB-ampicilina
extrato de levedura	Becton, Dickinson and Company	212750	usado para fazer placas de cultura LB-ampicilina
peptona	Merck	72161000	usada para fazer placas de cultura LB-ampicilina
TEMED	AMRESCO	761	usado para fazer géis de poliacrilamida
persulfato de amônio	Calbiochem	2310	usado para fazer géis de poliacrilamida
acrilamida	invitrogen	15512-023	usado para fazer géis de poliacrilamida
bisacrilamida	SIGMA	146072	usado para fazer géis de poliacrilamida
Tris-base	Merck	1083821000	usado para fazer tampão TAE e tampão tris-HCl gel de poliacrilamida não desnaturante
EDTA	J.T. Baker	8993-01	usado para fazer tampão TAE
Ácido acético	Merck	1.000.632.500	usado para fazer tampão TAE
agarose	Merck	16802	usado para fazer
espectrofotômetro	Tecan	infinite 200 pro	usado para quantificar o plasmídeo
de DNAunidade de purificação de água	Merck	Elix 100	usado para fazer água tipo 1 (ASTM) usado em espectrofotometria e diluições de DNA \
		destilada	usada em géis, meio de cultura, colorações e soluções gerais
HCl	J.T. Baker	9535-03	usado para fazer gel de poliacrilamida não desnaturante tris-HCl tampão
6X corante de carregamento de DNA	Thermo-Fisher	R0610
LED azul de 5 mm	Jinyuan electronics	SP-021	usada no teste de integridade
protoboard	KANDH	KH102	suporte de fonte de luz e circuito
Bateria de 9 V	Duracell-usada		para alimentar a
câmara de eletroforese horizontal	Biorad	1704486EDU	usado para fazer e executar gel de agarose em ensaio
de integridade kit de eletroforese vertical	Biorad	1658002EDU	usado para executar géis de poliacrilamida em curvas de calibração
fonte de alimentação	Biorad	1645050	usado para alimentar a eletroforese