Met behulp van een Microfluidics apparaat voor mechanische stimulatie en hoge resolutie Imaging van C. elegans
Summary
Nieuwe hulpmiddelen voor het mechanobiology onderzoek nodig zijn om te begrijpen hoe mechanische spanning activeert biochemische paden en lokt biologische reacties. Hier presenteren we een nieuwe methode voor selectief mechanische stimulatie van geïmmobiliseerdet dieren met een val van de microfluidic waardoor hoge resolutie beeldvorming van cellulaire reacties.
Abstract
Een centrale doelstelling van mechanobiology is te begrijpen van de wederzijdse invloed van mechanische belasting op eiwitten en cellen. Ondanks het belang ervan, is de invloed van mechanische belasting op cellulaire functie nog slecht begrepen. Gedeeltelijk bestaat deze kenniskloof omdat enkele hulpmiddelen gelijktijdige vervorming van weefsels en cellen, beeldvorming van cellulaire activiteit in levende dieren en efficiënte beperking van de beweeglijkheid in anders zeer mobiele modelorganismen, zoals de nematode kunt Caenorhabditis elegans. De kleine grootte van C. elegans maakt ze een uitstekende match op microfluidics gebaseerde onderzoek apparaten, en oplossingen voor immobilisatie zijn aangebracht met behulp van microfluidic-apparaten. Hoewel deze apparaten toestaan voor hoge resolutie beeldvorming, is het dier volledig ingekapseld in Polydimethylsiloxaan (PDMS) en glas, het beperken van fysieke toegang voor de levering van de mechanische kracht of elektrofysiologische opnames. Onlangs, we hebben een apparaat dat integreert pneumatische aandrijvingen met een overlapping design die compatibel is met hoge-resolutie fluorescentie microscopie. Het kanaal van de bediening wordt gescheiden van de worm-overlapping kanaal door een dunne PDMS diafragma. Dit membraan wordt afgebogen in de zijkant van een worm door druk uit te oefenen vanuit een externe bron. Het apparaat kan richten op individuele mechanosensitive neuronen. De activering van deze neuronen is beeld op hoge resolutie met genetisch-gecodeerde calcium indicatoren. Dit artikel presenteert de algemene methode met behulp van C. elegans spanningen uiten calcium-gevoelige activiteitsindicator (GCaMP6s) in hun aanraking receptor neuronen (TRNs). De methode is niet beperkt tot TRNs noch tot calcium sensoren als een sonde, maar kan worden uitgebreid tot andere mechanisch-gevoelige cellen of sensoren.
Introduction
Het gevoel van aanraking biedt dieren met cruciale informatie over hun omgeving. Afhankelijk van de toegepaste kracht, wordt aanraking waargenomen als onschuldig, plezierig of pijnlijk. De vervorming van de weefsel tijdens aanraking wordt gedetecteerd door gespecialiseerde mechanoreceptor cellen ingebed in de huid die uitdrukken van receptor eiwitten, meestal ionenkanalen. De stappen die kracht perceptie koppelen tot activering van het kanaal van de ion tijdens touch en pijn zijn niet volledig begrepen. Nog minder is bekend over hoe het huidweefsel filters mechanische vervorming en of mechanoreceptors opsporing van wijzigingen in spanning of stress1,2,3. Deze kloof in begrip ontstaat, gedeeltelijk uit een gebrek aan geschikte instrumenten nauwkeurige mechanische stimulaties worden toegepast op het oppervlak van de huid van een levend dier tijdens het observeren van de reacties op cellulair niveau. Overwegende dat de atomaire kracht microscopie is uitvoerig gebruikt toe te passen en meten van krachten in geïsoleerde cellen4,5 , en ook om te activeren Piezo1 receptoren in levende cellen6, soortgelijke experimenten met behulp van levende dieren, met name C. elegans, zijn notoir uitdagend vanwege de intrinsieke mobiliteit van het onderwerp. Deze uitdaging is traditioneel omzeild door het gebruik van veterinaire – of chirurgische grade Cyanoacrylaat lijm te immobiliseren van individuele dieren op agar pads1,7,8,9. Deze aanpak is productief, maar heeft beperkingen met betrekking tot de vaardigheid die nodig is voor immobilisatie door lijmen en de oppervlakte van de zachte agar op mechanische naleving. Een microfluidics strategie is een gratis alternatief, dat enkele van de complicaties die verband houden vermijdt met het lijmen.
De nematode C. elegans is een genetisch modelorganisme met een volledig toegewezen zenuwstelsel dat, vanwege de grootte van het dier, een goed geschikt voor microfluidics technologie is. Microfluidics-gebaseerde apparaten bieden het voordeel dat het anders zeer mobiele dieren kunnen worden gefixeerd tijdens het uitvoeren van high-resolution beeldvorming en levering van relevante neuro-f stimuli. Met de hulp van microfluidic kunnen technologieën, leven dieren zonder schade10,11, waardoor controle van gedrags bedrijvigheid gedurende de gehele levensduur12,13 en met hoge resolutie worden geïmmobiliseerd Imaging van neuronale activiteit14,15,16,17. Verder veel mechanoreceptor neuronen die nodig is voor het gevoel van aanraking en pijn kan gekarakteriseerd worden op hun fysiologische1,8, mechanische4,18,19, en moleculaire niveau20,21,22.
C. elegans zintuigen zachte mechanische prikkels aan de muur van haar lichaam met behulp van zes TRNs, waarvan er drie innervate van het dier anterior (ALML/R en AVM) en drie van die innervate van het dier posterior (PLML/R en PVM). De ion kanaal moleculen die nodig zijn voor het transducing een toegepaste kracht in een biochemische signaal zijn uitvoerig bestudeerd in haar TRNs8. Dit artikel presenteert een microfluidic platform23 waarmee onderzoekers toe te passen nauwkeurige mechanische krachten op de huid van een geïmmobiliseerdet C. elegans rondworm, terwijl het uitlezen van de vervorming van zijn interne weefsels door optische beeldvorming. Naast de presentatie van welomschreven mechanische stimuli, kunnen calcium transiënten worden opgenomen in de mechanoreceptor neuronen met subcellular resolutie en gecorreleerd met morfologische en anatomische kenmerken. Het apparaat bestaat uit een centrale overlapping-kanaal dat een enkel dier houdt en presenteert haar huid naast Pneumatische bediening kanalen (Figuur 1 pt Figuur 2). De zes kanalen staan langs het kanaal van de overlapping voor mechanische prikkels naar elk van de zes TRNs van de worm. Deze kanalen zijn gescheiden van de kamer van de overlapping door dunne PDMS pessarium, die kunnen worden aangedreven door een externe lucht druk bron (Figuur 1). Wij gekalibreerd de uitwijking ten opzichte van de druk en de metingen in dit artikel bieden. Elke actuator kan worden individueel gericht en gebruikt ter stimulering van een mechanoreceptor van keuze. De druk wordt geleverd met een piëzo-gedreven drukpomp maar alternatieve apparaat kan worden gebruikt. We laten zien dat de druk-protocol kan worden gebruikt om te activeren TRNs in vivo en demonstreren van huishoudelijke apparaten geschikt voor het leveren van mechanische stimuli aan volwassen C. elegans, laden van volwassen dieren in apparaten, uitvoeren van calcium imaging experimenten, en analyseren van de resultaten. Apparaat fabricage bestaat uit twee hoofdstappen: 1) fotolithografie te maken van een mal van SU-8; en 2) molding PDMS om een apparaat te maken. Ter wille van de beknoptheid en duidelijkheid, worden lezers verwezen naar eerder gepubliceerde artikelen en protocollen24,25 voor instructies over hoe de mallen en de apparaten te produceren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol wordt een methode voor het leveren van nauwkeurige mechanische stimulatie aan de huid van een rondworm gevangen in een microfluidic chip gedemonstreerd. Het is bedoeld ter vergemakkelijking van de integratie van fysieke stimuli voor het beantwoorden van de vragen van de biologische en wil stroomlijnen mechanobiology onderzoek in biologische laboratoria. Deze methode breidt vorige tests om te beoordelen van de functie van de mechanosensory neuronen in C. elegans. Vorige kwantitatieve en semi-kwantita…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Sandra N. Manosalvas-Kjono, Purim Ladpli, Farah Memon, Divya Gopisetty en Veronica Sanchez voor ondersteuning in ontwerp en productie van mutant dieren. Dit onderzoek werd gesteund door de NIH subsidies R01EB006745 (BLP), R01NS092099 (naar MBG), K99NS089942 (aan MK), F31NS100318 (aan de ALN) en ontvangen financiering van de Europese Onderzoeksraad (EOR) onder de Horizon 2020 onderzoek en de innovatie van de Europese Unie program () subsidieovereenkomst No. 715243 aan MK).
Materials
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric – imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
Referências
- Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
- Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
- Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
- Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Li, S., Stone, H. a., Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
- Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
- Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
- Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
- Arnadóttir, J., O’Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
- Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
- Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O’hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
- Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
- Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
- Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
- Petzold, B. C., Park, S. -. J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
- Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
- Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
- Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).
