यांत्रिक उत्तेजना और सी. एलिगेंस के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक Microfluidics डिवाइस का उपयोग करना
Summary
mechanobiology अनुसंधान के लिए नए उपकरणों को समझने की जरूरत कैसे यांत्रिक तनाव जैव रासायनिक रास्ते को सक्रिय करता है और जैविक प्रतिक्रियाओं को बटोरता है । यहां, हम एक microfluidic सेलुलर प्रतिक्रियाओं के उच्च संकल्प इमेजिंग की अनुमति जाल के साथ स्थिर पशुओं के चयनात्मक यांत्रिक उत्तेजना के लिए एक नई विधि का प्रदर्शन ।
Abstract
mechanobiology का एक केंद्रीय लक्ष्य प्रोटीन और कोशिकाओं पर यांत्रिक तनाव के पारस्परिक प्रभाव को समझने के लिए है । इसके महत्व के बावजूद, सेलुलर समारोह पर यांत्रिक तनाव के प्रभाव को अभी भी खराब समझ है । भाग में, इस ज्ञान अंतर मौजूद है क्योंकि कुछ उपकरण ऊतक और कोशिकाओं के एक साथ विरूपण सक्षम, जीवित पशुओं में सेलुलर गतिविधि की इमेजिंग, और अंयथा उच्च मोबाइल मॉडल जीवों में गतिशीलता के कुशल प्रतिबंध, जैसे निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस। सी. एलिगेंस के छोटे आकार उंहें microfluidics आधारित अनुसंधान उपकरणों के लिए एक उत्कृष्ट मैच बनाता है, और स्थिरीकरण के लिए समाधान microfluidic उपकरणों का उपयोग कर प्रस्तुत किया गया है । हालांकि इन उपकरणों उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं, पशु पूरी तरह से polydimethylsiloxane (PDMS) और कांच में, यांत्रिक बल या electrophysiological रिकॉर्डिंग के वितरण के लिए भौतिक अभिगम सीमित है । हाल ही में, हम उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ संगत है कि एक फँसाने डिजाइन के साथ वायवीय प्रेरक एकीकृत करता है कि एक डिवाइस बनाया. actuation चैनल एक पतली PDMS डायाफ्राम द्वारा कीड़ा फँसाने चैनल से अलग है । इस डायाफ्राम एक बाहरी स्रोत से दबाव लागू करने से एक कीड़ा के पक्ष में विक्षेपित है । डिवाइस व्यक्तिगत mechanosensitive ंयूरॉंस को लक्षित कर सकते हैं । इन ंयूरॉंस के सक्रियकरण आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतकों के साथ उच्च संकल्प पर imaged है । यह आलेख सामांय विधि को उनके स्पर्श रिसेप्टर न्यूरॉन्स (TRNs) में कैल्शियम के प्रति संवेदनशील गतिविधि संकेतक (GCaMP6s) व्यक्त C. एलिगेंस उपभेदों का उपयोग कर प्रस्तुत करता है । विधि, तथापि, TRNs करने के लिए और न ही एक जांच के रूप में कैल्शियम सेंसर करने के लिए सीमित नहीं है, लेकिन अन्य यांत्रिक संवेदनशील कोशिकाओं या सेंसर करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है.
Introduction
स्पर्श की भावना अपने पर्यावरण के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी के साथ पशुओं को प्रदान करता है । लागू बल पर निर्भर करता है, स्पर्श अहानिकर, आनंददायक, या दर्दनाक के रूप में माना जाता है । संपर्क के दौरान ऊतक विकृति विशेष mechanoreceptor त्वचा है कि एक्सप्रेस रिसेप्टर प्रोटीन, सबसे अधिक आयन चैनल में एंबेडेड कोशिकाओं द्वारा पता लगाया है । स्पर्श और दर्द के दौरान आयन चैनल सक्रियण के लिए बल धारणा को जोड़ने कदम पूरी तरह से समझ नहीं कर रहे हैं । इससे भी कम के बारे में जाना जाता है कैसे त्वचा ऊतक यांत्रिक विकृति फ़िल्टर और चाहे mechanoreceptors तनाव या1,2,3में परिवर्तन का पता लगाने । समझ में यह अंतर उठता है, भाग में, उपयुक्त उपकरणों की कमी से एक जीवित जानवर की त्वचा की सतह के लिए सटीक यांत्रिक उत्तेजना लागू करते हुए सेलुलर स्तर पर प्रतिक्रियाओं को देख । जबकि परमाणु बल माइक्रोस्कोपी बड़े पैमाने पर लागू करने के लिए और अलग कोशिकाओं4,5 में बलों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है और भी जीवित कोशिकाओं6में Piezo1 रिसेप्टर्स को सक्रिय करने के लिए, समान प्रयोगों जीवित पशुओं का उपयोग, विशेष रूप से C. एलिगेंस, इस विषय की आंतरिक गतिशीलता के कारण बेहद चुनौतीपूर्ण रहा है । इस चुनौती को परंपरागत रूप से पशु चिकित्सा-या शल्य चिकित्सा ग्रेड cyanoacrylate गोंद का उपयोग कर आगर पैड1,7,8,9पर व्यक्तिगत पशुओं को स्थिर करने से दरकिनार कर रहा है । यह दृष्टिकोण उत्पादक है, लेकिन gluing द्वारा स्थिरीकरण और यांत्रिक अनुपालन पर नरम आगर सतह के लिए आवश्यक कौशल से संबंधित सीमाएं हैं । एक microfluidics रणनीति एक मानार्थ विकल्प है कि gluing से जुड़ी जटिलताओं के कुछ बचा जाता है ।
निमेटोड सी एलिगेंस एक पूरी तरह से मैप तंत्रिका तंत्र के साथ एक आनुवंशिक मॉडल जीव है कि, जानवर के आकार के कारण, microfluidics प्रौद्योगिकी के लिए एक अच्छी फिट है । Microfluidics-आधारित उपकरणों उच्च संकल्प इमेजिंग और प्रासंगिक तंत्रिका-modulatory उत्तेजनाओं के वितरण प्रदर्शन करते हुए अन्यथा अत्यंत मोबाइल जानवरों को रोका जा सकता है कि लाभ प्रदान करते हैं । microfluidic प्रौद्योगिकियों की मदद से, जीवित पशुओं को नुकसान पहुंचाए बिना10,11, पूरे जीवनकाल में12,13 और उच्च-रिज़ॉल्यूशन पर व्यवहार गतिविधि की निगरानी सक्षम कर सकते हैं न्यूरॉन गतिविधि की इमेजिंग14,15,16,17. इसके अलावा, कई mechanoreceptor को छूने और दर्द की भावना के लिए आवश्यक ंयूरॉंस उनके शारीरिक1,8, यांत्रिक4,18,19, और आणविक पर विशेषता हो सकती है तर२०,२१,२२.
C. एलिगेंस होश कोमल यांत्रिक उत्तेजनाओं अपने शरीर की दीवार के लिए छह TRNs, जिनमें से तीन अंदर आना है पशु पूर्वकाल (ALML/आर और एवीएम) और तीन जिनमें से पशु के पीछे अंदर आना (PLML/ आयन चैनल एक जैव रासायनिक संकेत में एक लागू बल transducing के लिए आवश्यक अणुओं को बड़े पैमाने पर अपनी TRNs8में अध्ययन किया गया है । इस अनुच्छेद के एक microfluidic मंच23 प्रस्तुत करता है कि शोधकर्ताओं ने एक मैटीरियल सी एलिगेंस roundworm की त्वचा के लिए सटीक यांत्रिक बलों को लागू करने के लिए, जबकि ऑप्टिकल इमेजिंग द्वारा अपने आंतरिक ऊतकों की विकृति को पढ़ने के लिए सक्षम बनाता है । अच्छी तरह से परिभाषित यांत्रिक उत्तेजनाओं पेश करने के अलावा, कैल्शियम यात्रियों mechanoreceptor न्यूरॉन्स में उपसेलुलर संकल्प के साथ दर्ज किया जा सकता है और रूपात्मक और संरचनात्मक सुविधाओं के साथ संबंधित. उपकरण एक केंद्रीय फँसाने चैनल है कि एक ही जानवर रखती है और छह वायवीय actuation चैनलों के बगल में अपनी त्वचा प्रस्तुत करता है (चित्रा 1 और चित्रा 2) के होते हैं । छह चैनल कीड़ा छह TRNs में से प्रत्येक के लिए यांत्रिक उत्तेजनाओं देने के लिए ट्रैपिंग चैनल के साथ तैनात हैं । ये चैनल पतला PDMS डायाफ्राम, जो एक बाहरी हवा के दबाव स्रोत (चित्रा 1) द्वारा संचालित किया जा सकता द्वारा ट्रैपिंग चैंबर से अलग कर रहे हैं. हम दबाव और इस लेख में माप प्रदान करने के लिए संबंध के साथ झुकाव पर तुले हुए हैं । प्रत्येक गति व्यक्तिगत रूप से संबोधित किया जा सकता है और पसंद की एक mechanoreceptor को उत्तेजित करने के लिए इस्तेमाल किया । दबाव एक पीजो चालित दबाव पंप का उपयोग कर दिया है, लेकिन किसी भी वैकल्पिक उपकरण इस्तेमाल किया जा सकता है । हम बताते हैं कि दबाव प्रोटोकॉल TRNs vivo में सक्रिय करने और वयस्क C. एलिगेंसकरने के लिए यांत्रिक उत्तेजनाओं देने, उपकरणों में वयस्क जानवरों लोड करने के लिए उपयुक्त ऑपरेटिंग उपकरणों का प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, कैल्शियम इमेजिंग प्रदर्शन प्रयोगों, और परिणामों का विश्लेषण । उपकरण निर्माण के दो मुख्य कदम होते हैं: 1) photolithography SU-8 से एक मोल्ड बनाने के लिए; और 2) मोल्डिंग PDMS एक डिवाइस बनाने के लिए । संक्षिप्तता और स्पष्टता के लिए, पाठकों को पहले प्रकाशित लेख और प्रोटोकॉल24,25 के लिए कैसे मोल्ड और उपकरणों के उत्पादन पर निर्देशों के लिए भेजा जाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल एक microfluidic चिप में फंस roundworm की त्वचा के लिए सटीक यांत्रिक उत्तेजना देने के लिए एक विधि को दर्शाता है । यह जैविक प्रश्नों का उत्तर देने के लिए शारीरिक उत्तेजनाओं के एकीकरण की सुविधा का उद्देश्य …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम सैंड्रा N Manosalvas-Kjono, प्युरीम Ladpli, फराह योगेंद्र, दिव्या Gopisetty, और डिवाइस डिजाइन और उत्परिवर्ती जानवरों की पीढ़ी में समर्थन के लिए वेरोनिका सांचेज धंयवाद । इस शोध को NIH पलाश R01EB006745 (टू BLP), R01NS092099 (टू MBG), K99NS089942 (एमके को), F31NS100318 (टू ALN) द्वारा समर्थित किया गया और यूरोपियन रिसर्च काउंसिल (ईआरसी) से यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम के अंतर्गत धन प्राप्त हुआ ( ग्रांट एग्रीमेंट नंबर ७१५२४३ से एमके).
Materials
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric – imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
Referências
- Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
- Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
- Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
- Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Li, S., Stone, H. a., Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
- Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
- Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
- Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
- Arnadóttir, J., O’Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
- Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
- Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O’hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
- Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
- Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
- Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
- Petzold, B. C., Park, S. -. J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
- Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
- Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
- Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).
