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Neurociência

Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans

Published: February 19, 2018
doi:
10.3791/56530
, , , , ,
1Department of Molecular and Cellular Physiology,Stanford University, 2Department of Mechanical Engineering,Stanford University, 3Department of Bioengineering,Stanford University, 4Group of Neurophotonics and Mechanical Systems Biology,The Institute of Photonic Sciences (ICFO)

Summary

Novas ferramentas para pesquisa de mechanobiology são necessários para compreender o estresse mecânico como ativa vias bioquímicas e elicia respostas biológicas. Aqui, vamos mostrar um novo método para a estimulação mecânica seletiva dos animais imobilizados com uma armadilha de microfluidic permitindo imagens de alta resolução de respostas celulares.

Abstract

Um objetivo central da mechanobiology é entender o efeito recíproco de estresse mecânico em proteínas e células. Apesar de sua importância, a influência do estresse mecânico na função celular é ainda mal compreendida. Em parte, essa lacuna de conhecimento existe porque alguns ferramentas permitem a deformação simultânea de tecidos e células, imagens da atividade celular em animais vivos e eficiente restrição da motilidade em organismos-modelo caso contrário altamente móveis, tais como o nematódeo Caenorhabditis elegans. O pequeno tamanho da c. elegans -los faz um excelente partido para dispositivos de microfluídica-com base em pesquisa, e foram apresentadas soluções para imobilização usando dispositivos microfluídicos. Embora estes dispositivos permitem imagens de alta resolução, o animal é totalmente envolto em polydimethylsiloxane (PDMS) e vidro, limitando o acesso físico para entrega de força mecânica ou eletrofisiológicas gravações. Recentemente, criamos um dispositivo que integra actuadores pneumáticos com um design de captura compatível com microscopia de fluorescência de alta resolução. O canal de atuação é separado pelo canal da interceptação de verme por uma fina membrana PDMS. Este diafragma é desviada para o lado de um verme aplicando pressão de uma fonte externa. O dispositivo pode direcionar os neurônios mechanosensitive individuais. A ativação desses neurônios é fotografada em alta resolução com indicadores de cálcio geneticamente codificado. Este artigo apresenta o método geral usando cepas de c. elegans , expressando o indicador de atividade de cálcio sensíveis (GCaMP6s) em seus neurônios receptores de toque (TRNs). O método, no entanto, não está limitado aos TRNs nem aos sensores de cálcio como uma sonda, mas pode ser expandido para outras células mecanicamente sensíveis ou sensores.

Introduction

O sentido do tato fornece animais com informações cruciais sobre seu ambiente. Dependendo da força aplicada, o toque é percebido como inócuo, prazeroso ou doloroso. A deformação do tecido durante o toque é detectada pelas células especializadas Mecanorreceptor incorporadas na pele que expressam proteínas do receptor, mais comumente canais iônicos. As etapas ligando a percepção da força para ativação de canal de íon durante o toque e a dor não são totalmente compreendidas. Menos ainda se sabe sobre como o tecido da pele filtra deformação mecânica e se mecanorreceptores detectam alterações na tensão ou stress1,2,3. Esta lacuna na compreensão decorre, em parte, a falta de ferramentas adequadas para aplicar estímulos mecânicos precisos para a superfície da pele de um animal vivo enquanto observa as respostas a nível celular. Considerando que a microscopia de força atômica tem sido amplamente utilizada para aplicar e medir forças em células isoladas de4,5 e também para ativar receptores Piezo1 em vida células6, experimentos semelhantes usando animais vivos, especialmente C. elegans, têm sido notoriamente desafiadora devido a mobilidade intrínseca do assunto. Tradicionalmente, este desafio é contornado usando cola de cianoacrilato de veterinária – ou -grau cirúrgico para imobilizar animais individuais em ágar almofadas1,7,8,9. Esta abordagem tem sido produtiva, mas tem limitações relacionadas com a habilidade necessária para a imobilização por colagem e superfície do agar macio na conformidade mecânica. Uma estratégia de microfluídica é uma alternativa gratuita que evita algumas das complicações ligadas à colagem.

O nemátodo c. elegans é um organismo modelo genético cujo sistema nervoso completamente mapeado que, devido ao tamanho do animal, é uma boa opção para tecnologia microfluídica. Oferta de dispositivos baseados em microfluídica a vantagem que os animais caso contrário extremamente móveis podem ser contidos durante a execução de imagens de alta resolução e entrega de estímulos neuro-moduladora relevantes. Com a ajuda de microfluidic tecnologias, vivem animais podem ser imobilizadas sem dano10,11, permitindo o monitoramento da atividade comportamental ao longo da vida inteira de12,13 e de alta resolução imagem de atividade neuronal14,15,16,17. Além disso, muitos neurônios Mecanorreceptor necessários para o sentido de toque e a dor pode ser caracterizado em sua fisiológicas1,8, mecânica4,18,19e molecular nível20,21,22.

C. elegans sentidos suaves estímulos mecânicos para sua parede do corpo usando seis TRNs, três dos quais inervam do animal anterior (ALML/R e AVM) e três dos quais inervam posterior do animal (PLML/R e PVM). As moléculas de canal de iões necessárias para transducing uma força aplicada em um sinal de bioquímico têm sido muito estudadas em seu TRNs8. Este artigo apresenta uma plataforma microfluidic23 que permite que os investigadores a aplicar forças mecânicas precisas na pele de um imobilizado c. elegans lombriga, ao ler a deformação de seus tecidos internos pela imagem latente ótica. Além de apresentar estímulos mecânicos bem definidos, transientes de cálcio podem ser gravados em neurônios Mecanorreceptor com resolução subcellular e correlacionados com características morfológicas e anatômicas. O dispositivo consiste de um canal central de interceptação que mantém um único animal e apresenta sua pele ao lado de seis canais de acionamento pneumático (Figura 1 e Figura 2). Os seis canais estão posicionados ao longo do canal de armadilhas para entregar a estímulos mecânicos para cada um dos seis TRNs do worm. Estes canais são separados da câmara de captura por diafragmas PDMS finos, que podem ser conduzidos por uma fonte de pressão do ar externo (Figura 1). Nós calibrado a deflexão em relação a pressão e fornecer as medições neste artigo. Cada atuador pode ser abordada individualmente e usado para estimular um Mecanorreceptor de escolha. A pressão é fornecida usando uma bomba de pressão piezo-driven, mas qualquer dispositivo alternativo pode ser usado. Nós mostramos que o protocolo de pressão pode ser usado para ativar TRNs na vivo e demonstrar o funcionamento dispositivos adequados para entrega de estímulos mecânicos para adultos c. elegans, carregar animais adultos em dispositivos, realizando a imagem latente de cálcio experiências e analisando os resultados. Fabricação de dispositivo consiste de duas etapas principais: 1) fotolitos para fazer um molde de SU-8; e 2) PDMS para tornar um dispositivo de moldagem. Por uma questão de brevidade e clareza, os leitores são referidos anteriormente publicados artigos e protocolos24,25 para obter instruções sobre como produzir os moldes e dispositivos.

Protocol

1. dispositivo fabricação Baixe o arquivo de máscara (arquivo suplementar 1) e gerar uma máscara de cromo usando um serviço comercial ou instalações in-house. Como a menor dimensão no dispositivo é 10 µm (espessura de membrana do atuador), certifique-se de que a máscara tem resolução suficientemente alta, dentro de ± 0,25 µm, para produzir os recursos. Seguir métodos de fotolitografia padrão SU-8 (por exemplo, referências24</…

Representative Results

SU-8 litografia e colagem de ChipO protocolo de litografia e moldagem de PDMS sigam os procedimentos padrão. Detalhes podem ser encontrados em outros lugares23,24,25,26. O PDMS deve descascar fora a hóstia sem problemas após a cura. Se os recursos de SU-8 arrancar durante o descascamento de PDMS, ou a camada de aderência de SU-8 ou a sil…

Discussion

Este protocolo demonstra um método de distribuição precisa estimulação mecânica na pele de uma lombriga, presa em um chip microfluidic. Destina-se a facilitar a integração dos estímulos físicos para responder às perguntas biológicas e visa agilizar a pesquisa de mechanobiology em laboratórios biológicos. Esse método amplia anteriores ensaios para avaliar a função dos neurônios mechanosensory em c. elegans. Técnicas quantitativas e semi-quantitativa anteriores medido forças1<…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Sandra N. Manosalvas-Kjono, Ladpli de Purim, Farah Memon, Divya Gopisetty e Veronica Sanchez para apoiar no projeto de dispositivo e geração de animais mutantes. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios de NIH R01EB006745 (a BLP), R01NS092099 (para MBG), K99NS089942 (a MK), F31NS100318 (a ALN) e recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação (CEI), sob o Horizonte 2020 pesquisa e inovação da União Europeia (do programa Convenção de subvenção n. º 715243 para MK).

Materials

Chrome mask Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
Chrome mask Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.)
4'' Silicon wafer (B-test) Stanford Nanofabrication Facility
SU-8 2002 MicroChem
SU-8 2050 MicroChem
Spin-coater Laurell Technologies WS-400BZ-6NPP/LITE
Exposure timer Optical Associates, Inc OAI 150
Illumination controller Optical Associates, Inc 2105C2
SU-8 developer MicroChem
2-Propanol Fisher Scientific A426F-1GAL
Acetone Fisher Scientific A18-4
Trichloromethylsilane (TCMS) Sigma-Aldrich 92361-500ML Caution: TCMS is toxic and water-reactive
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS prepolymer
Biopsy punch, 1 mm VWR 95039-090
Oxygen Plasma Asher Branson/IPC
Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW New England Small Tube Corporation NE-1300-01
Nalgene syringe filter, 0.22 μm Thermo Scientific 725-2520 to filter all solution, small particles would clog the chip
Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID Solomon Scientific BPE-T50
Syringe, 1 ml BD Scientific 309628 for worm trapping and release
Syringe, 20 ml BD Scientific 309661 for gravity-based flow
Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump Gilson to suck solutions and worms out of the chip
Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel Elveflow OB1 MK3 pressure delivery
Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD McMaster-Carr 5195 T52 connection from house air to pressure pump
Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD McMaster-Carr 5195 T51 connect pressure pump to small tubng
Push-to-Connect Tube Fitting for Air McMaster-Carr 5111K468 metric – imperial converter
Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD McMaster-Carr 5779 K258
Leica DMI 4000 B microscopy system Leica
63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective Leica 506081
Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera Hamamatsu C11440-42U
Lumencor Spectra X light engine Lumencor With cyan and green/yellow light source
Excitation beam splitter Chroma 59022bs in the microscope
Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics Hamamatsu A12801-01 to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip
Emission beam splitter Chroma T570lpxr in the image splitter
Emission filters GCamp6s Chroma ET525/50m in the image splitter
Emission filters mCherry Chroma ET632/60m in the image splitter
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Referências

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MicrofluidicsMechanical StimulationHigh-resolution ImagingC. ElegansMechanobiologySensory BiologyPressure ActuatorsGCaMPRFPFluorescence MicroscopyM9 BufferPeristaltic PumpPDMS
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Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans. J. Vis. Exp. (132), e56530, doi:10.3791/56530 (2018).
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