С помощью микрофлюидика устройства для механической стимуляции и высокой резолюции визуализация C. elegans
Summary
Новые инструменты для исследований mechanobiology нужно, чтобы понять как механическому активизирует биохимические пути и вызывает биологических реакций. Здесь мы представляем новый метод для селективного механической стимуляции подвижности животных с microfluidic ловушку, позволяя с высоким разрешением изображений клеточных реакций.
Abstract
Одна центральная цель mechanobiology — понять взаимное влияние механических напряжений на белки и клетки. Несмотря на свою важность влияние механических напряжений на клеточную функцию еще плохо поняты. В частности этот пробел в знаниях существует потому, что некоторые инструменты позволяют одновременное деформации ткани и клетки, визуализации клеточной активности в живых животных, а также эффективное ограничение подвижности в противном случае мобильных модель организмов, таких как нематода Caenorhabditis elegans. Небольшой размер C. elegans делает их отличный матч для устройств на базе микрофлюидика исследований, и были представлены решения для иммобилизации, используя microfluidic приборы. Хотя эти устройства позволяют для изображений с высоким разрешением, животное полностью помещены в полидиметилсилоксан (PDMS) и стекла, ограничение физического доступа для доставки механической силы или электрофизиологических записей. Недавно мы создали устройство, которое интегрирует пневматические приводы с треппинга дизайн, который совместим с высоким разрешением флуоресцентной микроскопии. Срабатывание канал отделяется от червя треппинга канала Тонкая диафрагма PDMS. Эта диафрагма отклоняются в сторону червя, применяя давление от внешнего источника. Устройство можно ориентировать отдельных mechanosensitive нейронов. Активация этих нейронов образы в с высоким разрешением с показателями генетически закодированный кальция. Эта статья содержит общий метод с использованием штаммов C. elegans , выражая индикатор активности кальция чувствительных (GCaMP6s) в их сенсорный рецепторных нейронов (TRNs). Метод, однако, не ограничено TRNs, ни кальция датчики для тестирования, но может быть расширена до других механически чувствительные клетки или датчиков.
Introduction
Осязание обеспечивает животных с важной информации об окружающей их среде. В зависимости от силы touch воспринимается как безобидные, приятным или болезненным. Ткани деформации во время касания определяется специализированных механорецептора клетки, встроенные в коже, которые Экспресс рецептор белков, наиболее часто иона каналы. Шаги, связывание силы восприятие ионного канала активации во время касания и боль полностью не поняты. Еще меньше известно о как ткани кожи фильтры механической деформации и ли механорецепторов обнаруживать изменения напряжения или подчеркнуть1,2,3. Этот разрыв в понимании возникает, в частности, из-за отсутствия подходящих инструментов для применения точной механической стимуляции к поверхности кожи живых животных соблюдая ответы на клеточном уровне. В то время как широко используется атомно-силовой микроскопии применяются и измерения силы в изолированных клеток4,5 , а также для того чтобы активировать Piezo1 рецепторов в живых клетках6, подобные эксперименты с использованием живых животных, особенно C. elegans, были крайне сложной из-за внутренней мобильности субъекта. Эта проблема традиционно обойти с помощью ветеринарной или хирургические класса Цианакрилатный клей для иммобилизации отдельных животных агар прокладки1,,78,9. Этот подход был продуктивным, но имеет ограничения, связанные с навыки, необходимые для иммобилизации, склеивания и поверхности мягкой агар механического соблюдения. Микрофлюидика стратегия является бесплатная альтернатива, которая позволяет избежать некоторых осложнений, связанных с склеивания.
Нематоду C. elegans является генетическим модельный организм с полностью сопоставленных нервной системы, которая, из-за размера животного, является подходящим для микрофлюидика технологии. Устройства на базе микрофлюидика предлагают преимущество, что в противном случае чрезвычайно мобильный животных может удерживаться во время выполнения с высоким разрешением изображения и доставки соответствующих нейро модулирующее раздражителей. С помощью microfluidic технологий, живущих животных может быть иммобилизованным без вреда10,11, включение мониторинга поведенческой активности за весь срок12,13 и с высоким разрешением Визуализация активности нейронов14,,1516,17. Кроме того, многие механорецептора нейронов, необходимые для чувство касания и боль можно охарактеризовать их физиологических1,8, Механическая4,18,19и молекулярных уровень20,21,22.
C. elegans чувства нежный механических раздражителей для ее стенки тела с помощью шести TRNs, три из которых иннервируют переднюю животного (ALML/R и АВМ) и три из которых иннервируют животного кзади (PLML/R и PVM). Ионного канала молекулы, необходимые для преобразователя усилие в биохимических сигнал были широко изучены в своем TRNs8. Эта статья представляет microfluidic платформа23 , что позволяет исследователям для применения точных механических сил к коже иммобилизованных C. elegans аскариды, при чтении из деформации ее внутренних тканей, оптических изображений. Помимо представления четкой механических раздражителей, кальция переходные процессы можно записан в механорецептора нейронов с субцеллюлярные резолюции и коррелирует с морфологической и анатомические особенности. Устройство состоит из центрального треппинга канала, который держит одиночного животного и представляет ее кожи рядом с шести каналов пневматического привода (рис. 1 и рис. 2). Шесть каналов расположены вдоль канала треппинга для доставки механических раздражителей для каждого из шести TRNs червя. Эти каналы отделены от камеры треппинга тонкой PDMS мембраны, которые могут управляться источника давления наружного воздуха (рис. 1). Мы калиброванные прогиб относительно давления и проведения измерений в этой статье. Каждый привода могут быть рассмотрены индивидуально и используется для стимулирования механорецептора выбора. Давление доставляется с помощью пьезо driven давление насоса, но любое альтернативное устройство может быть использовано. Мы покажем, что протокол давления может использоваться для активации TRNs в естественных условиях и продемонстрировать эксплуатации устройства, пригодные для доставки механических раздражителей для взрослых C. elegans, Загрузка взрослых животных в устройств, выполняющих кальция изображений эксперименты и анализа результатов. Изготовление устройство состоит из двух основных этапов: 1) Фотолитография сделать плесень от Су-8; и 2) формования PDMS сделать устройство. Ради краткости и ясности читатели упоминаются ранее опубликованные статьи и протоколы24,25 для получения инструкций о том, как для создания плесени и устройств.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол демонстрирует метод для доставки точной механической стимуляции кожи аскариды, захваченных в microfluidic чип. Он предназначен для облегчения интеграции физических стимулов для ответов на вопросы биологического и стремится рационализировать mechanobiology исследований в области б…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Сандра н. Маносалвас-Kjono, Ladpli Пурим, Фарах Мемон, Дивья Gopisetty и Вероника Санчес для поддержки в конструкции устройства и поколение мутанта животных. Это исследование было поддержано NIH грантов R01EB006745 (БЛП), R01NS092099 (для MBG), K99NS089942 (для МК), F31NS100318 (для ALN) и получил финансирование от Европейского Совета исследований (ERC) под Европейского союза Horizon 2020 исследований и инноваций программы () Грантовое соглашение № 715243 в МК).
Materials
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric – imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
Referências
- Eastwood, A. L., et al. Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch. Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation. BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).
- Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin. Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).
- Krieg, M., et al. Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish. Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).
- Gaub, B. M., Müller, D. J. Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force. Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).
- Geffeney, S. L., et al. DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor. Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).
- O’Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).
- Suzuki, H., et al. In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation. Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).
- Kopito, R. B., Levine, E. Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues. Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).
- Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip. Lab Chip. 9 (1), 151 (2009).
- Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Li, S., Stone, H. a., Murphy, C. T. A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging. Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).
- Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).
- Mishra, B., et al. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J. Vis. Exp. , e50998 (2014).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Krajniak, J., Lu, H. Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies. Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).
- Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation. CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).
- Krieg, M., et al. Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling. Elife. 6 (2010), e20172 (2017).
- Arnadóttir, J., O’Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons. J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).
- Lockhead, D., et al. The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth. Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).
- Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O’hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation. Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).
- Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap. Lab Chip. , (2017).
- Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (119), e55276 (2017).
- Jenkins, G. Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography. Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).
- Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review. J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. SOFT LITHOGRAPHY. Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans. Lab Chip. , (2017).
- Edwards, S. L., et al. A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans. PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo. BiorXiv. , (2017).
- Petzold, B. C., Park, S. -. J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation. Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).
- Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans. PLoS One. 12 (5), e0178080 (2017).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).
- Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599 (2011).
- Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems. J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).
- Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle. Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).
