Usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de C. elegans
Summary
Nuevas herramientas para la investigación de la mecanobiología se necesitan entender cómo mecánico estrés activa vías bioquímicas y produce respuestas biológicas. Aquí, nos muestra un nuevo método de estimulación mecánica selectiva de animales inmovilizados con una trampa de microfluidos que permite proyección de imagen de alta resolución de las respuestas celulares.
Abstract
Un objetivo central de la mecanobiología es entender el efecto recíproco del estrés mecánico sobre las proteínas y las células. A pesar de su importancia, la influencia del estrés mecánico sobre la función celular es todavía mal entendida. En parte, esta brecha de conocimiento existe porque algunas herramientas permiten deformación simultánea de tejidos y células, la proyección de imagen de la actividad celular en los animales vivos y eficiente de movilidad en organismos modelo lo contrario altamente móviles, tales como el nematodo Elegans de Caenorhabditis. El tamaño pequeño de C. elegans hace un excelente partido a los dispositivos de investigación basada en microfluídica, y se presentan soluciones para la inmovilización con dispositivos microfluídicos. Aunque estos dispositivos permiten obtener imágenes de alta resolución, el animal está completamente dentro de polidimetilsiloxano (PDMS) y el vidrio, limita el acceso físico para la entrega de fuerza mecánica o las grabaciones electrofisiológicas. Recientemente, hemos creado un dispositivo que integra los actuadores neumáticos con un diseño de captura compatible con microscopía de fluorescencia de alta resolución. El canal de actuación se separa del canal atrapa el gusano por una delgada membrana PDMS. Este diafragma se encuentra en el lado de un gusano aplicando presión desde una fuente externa. El dispositivo puede dirigirse a las neuronas individuales mechanosensitive. La activación de estas neuronas es fotografiada en alta resolución con indicadores calcio codificados genéticamente. Este artículo presenta el método general utilizando cepas de C. elegans expresando su indicador de actividad de calcio-sensible (GCaMP6s) en sus neuronas de receptor del tacto (TRNs). El método, sin embargo, no se limita a TRNs ni sensores de calcio como una punta de prueba, pero puede ser ampliado a otras células mecánicamente sensibles o sensores.
Introduction
El sentido del tacto ofrece animales información crucial acerca de su entorno. Dependiendo de la fuerza aplicada, touch es percibida como inocua, placentera o dolorosa. La deformación del tejido durante el tacto es detectada por células especializadas mechanoreceptor incrustadas en la piel que expresan proteínas del receptor, comúnmente canales del ion. Los pasos a fuerza de percepción a la activación de canal de iones durante el tacto y el dolor no se entienden completamente. Menos aún se sabe sobre cómo el tejido de la piel filtros de deformación mecánica y si mecanorreceptores detectan cambios en la tensión o estrés1,2,3. Esta brecha en la comprensión se presenta, en parte, de la falta de herramientas adecuadas para aplicar estímulos mecánicos precisos a la superficie de la piel de un animal vivo observando las respuestas a nivel celular. Mientras que la microscopía de fuerza atómica se ha utilizado extensivamente para aplicar y medir fuerzas en células aisladas4,5 y activan los receptores Piezo1 en la vida de las células6, experimentos similares usando animales vivos, especialmente C. elegans, han sido notoriamente difícil debido a la movilidad intrínseca del sujeto. Este desafío es eludido tradicionalmente mediante el uso de pegamento del cianocrilato de grado quirúrgico o veterinario para inmovilizar animales individuales en agar cojines1,7,8,9. Este enfoque ha sido productivo, pero tiene limitaciones relacionadas con la habilidad necesaria para la inmovilización por encolado y la superficie del agar suave sobre el cumplimiento de la mecánica. Una estrategia de la microfluídica es una alternativa gratuita que evita algunas de las complicaciones vinculadas a pegar.
El nematodo C. elegans es un organismo modelo genético con un sistema nervioso completamente asignado que, debido al tamaño del animal, es un buen ajuste para la tecnología de microfluídica. Dispositivos de microfluidos ofrece la ventaja que los animales lo contrario extremadamente móviles pueden ser refrenados mientras se realiza la proyección de imagen de alta resolución y entrega de los estímulos neuro-modulador pertinentes. Con la ayuda de microfluidos tecnologías, animales vivos pueden ser inmovilizadas sin daño10,11, que permite el monitoreo de la actividad conductual sobre la vida de12,13 y alta resolución proyección de imagen de la actividad neuronal14,15,16,17. Además, muchas neuronas de mechanoreceptor necesarias para el sentido del tacto y del dolor puede ser caracterizado en su fisiológico1,8, mecánico4,18,19y molecular nivel20,21,22.
C. elegans detecta estímulos mecánicos suaves a la pared del cuerpo usando seis TRNs, tres de los cuales inervan el animal anterior (ALML más baja/R y AVM) y tres de los cuales inervan la parte posterior del animal (PLML/R y PVM). Las moléculas de canal de iones necesarias para la transducción de una fuerza aplicada en una señal bioquímica se han estudiado ampliamente en su TRNs8. Este artículo presenta una plataforma de microfluidos23 que permite a los investigadores a aplicar fuerzas mecánicas precisas a la piel de un inmovilizado de C. elegans ascáride, mientras leía a la deformación de los tejidos internos por proyección de imagen óptica. Además de presentar estímulos mecánicos bien definidos, transitorios de calcio pueden ser grabados en las neuronas mechanoreceptor con resolución subcelular y correlacionados con características morfológicas y anatómicas. El dispositivo consta de un canal central reventado que tiene un solo animal y presenta su piel junto a seis canales de accionamiento neumático (figura 1 y figura 2). Los seis canales se colocan a lo largo del canal de captura para entregar estímulos mecánicos a cada uno de seis TRNs del gusano. Estos canales están separados de la cámara de captura por finas membranas PDMS, que pueden ser impulsados por una fuente de presión de aire externa (figura 1). Calibrado de la desviación con respecto a la presión y proporcionar las medidas en este artículo. Cada actuador puede ser abordado individualmente y utilizado para estimular la mechanoreceptor de elección. La presión se suministra con una bomba de presión piezo-conducido pero puede utilizarse cualquier dispositivo alternativo. Mostramos que el protocolo de presión puede utilizarse para activar TRNs en vivo y demostrar funcionamiento dispositivos adecuados para entregar estímulos mecánicos para adultos C. elegans, carga de animales adultos en dispositivos, realizar proyección de imagen del calcio experimentos y analizar los resultados. Fabricación de dispositivo consta de dos pasos principales: 1) Fotolitografía para hacer un molde de SU-8; y 2) PDMS para hacer un dispositivo de moldeo. Aras de la brevedad y claridad, los lectores se conocen previamente publicados artículos y protocolos24,25 para obtener instrucciones sobre cómo producir los moldes y dispositivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo muestra un método para entregar precisa estimulación mecánica sobre la piel de un ascáride atrapado en un chip de microfluidos. Se pretende facilitar la integración de los estímulos físicos para responder a cuestiones biológicas y pretende agilizar investigación mecanobiología en laboratorios biológicos. Este método amplía análisis anteriores para evaluar la función de mechanosensory neuronas en C. elegans. Técnicas cuantitativas y semi cuantitativas anteriores miden fuerzas<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Sandra N. Manosalvas-Kjono, Ladpli de Purim, Farah Memon, Divya Gopisetty y Verónica Sánchez por apoyan en la generación de animales mutantes y diseño del dispositivo. Esta investigación fue apoyada por subvenciones de NIH R01EB006745 (Para BLP), R01NS092099 (a MBG), K99NS089942 (de MK), F31NS100318 (a ALN) y recibió financiación del Consejo Europeo de investigación (ERC) bajo investigación horizonte 2020 de la Unión Europea y la innovación programa () otorgar el acuerdo no. 715243 a MK).
Materials
| Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
| 4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
| SU-8 2002 | MicroChem | ||
| SU-8 2050 | MicroChem | ||
| Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
| Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
| SU-8 developer | MicroChem | ||
| 2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
| Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
| Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
| Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
| Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
| Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
| Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
| Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
| Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
| Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
| Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
| Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
| Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
| Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric – imperial converter |
| Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
| Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
| 63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
| Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
| Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
| Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
| Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
| Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
| Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
Referências
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