Verwendung von synaptischen Zink Histochemie, verschiedene Regionen und Schichten im Entwicklungs- und Erwachsenen Gehirn zu offenbaren
Summary
Wir beschreiben eine histochemische Prozedur, die charakteristische laminar und areal Zink Muster in verschiedenen Gehirnregionen Färbung zeigt. Das Zink-Färbung Muster kann in Verbindung mit anderen anatomischen Markierungen verwendet werden, um Schichten und Regionen im Entwicklungs- und Erwachsenen Gehirn zuverlässig zu unterscheiden.
Abstract
Charakterisierung der anatomischen und funktionellen Gehirn Organisation und Entwicklung erfordert genaue Identifizierung unterschiedliche neuronale Schaltkreise und Regionen im unreifen und Erwachsenen Gehirn. Hier beschreiben wir eine Zink histochemische Färbeverfahren, die Unterschiede in der Färbung Muster zwischen den verschiedenen Schichten und Hirnregionen offenbart. Andere haben dieses Verfahren nicht nur um die Verteilung von Zink-haltige Neuronen und Schaltkreise im Gehirn zu offenbaren, sondern auch erfolgreich areal und laminare Grenzen im Entwicklungs- und Erwachsenen Gehirn in mehrere Arten abgrenzen genutzt. Hier zeigen wir dies Färbeverfahren mit Bildern aus den Entwicklungsländern und Erwachsene Frettchen Gehirne. Wir offenbaren eine Zink-Färbung Muster, die als eine anatomische Marker von Bereichen und Schichten dient und visuelle kortikale Arealen in der Entwicklungs- und Erwachsenen Sehrinde unterscheiden zuverlässig einsetzbar. Das wichtigste Ziel dieses Protokolls ist es, eine histochemische Methode vorzustellen, die erlaubt die genaue Identifikation von Schichten und Regionen im Entwicklungs- und Erwachsenen Gehirn wo andere Methoden versagen, dies zu tun. Diese Methode ermöglicht in Verbindung mit densitometrische Bildanalyse, sekundär, zu beurteilen, die Verteilung der synaptischen Zink, mögliche Änderungen in der gesamten Entwicklung zu offenbaren. Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Reagenzien, Tools und erforderlichen Schritte zum gefrorenen Gehirn Abschnitte nacheinander zu beflecken. Obwohl dieses Protokoll mit Frettchen Hirngewebe beschrieben ist, kann es leicht für Nagetiere, Katzen oder Affen ebenso wie in anderen Hirnregionen angepasst werden.
Introduction
Histologischen Flecke haben traditionell verwendet, um bei der Identifizierung von kortikalen Areale in der verschiedenen Sorte zu unterstützen, durch die Hervorhebung der Unterschiede in der architektonischen Merkmale. Der kombinierte Einsatz von histochemische Techniken wie z. B. Nissl Substanz, Cytochrom-Oxidase (CO) Reaktivität oder Myelin kann fruchtbare beweisen, wie sie ähnliche areal Grenzen im erwachsenen Gehirn offenbaren. Diese histochemische Flecken zeigen jedoch nicht immer ausreichend klare Grenzen zwischen kortikalen Bereiche und Ebenen im unreifen Gehirn.
In das zentrale Nervensystem hat Zink mehrere wichtige Funktionen, die Stabilisierung der DNA-Struktur, als ein Enzym-Cofaktor, Teilnahme an zahlreichen regulatorischen Funktionen, und als ein Neuromodulator durch seine Präsenz in synaptischen Vesikel enthalten 1. Synaptic Zink ist einzigartig, da es kann mit histologischen Methoden visualisiert werden kann nicht proteingebundene Zink visualisierte2vorzusehen. Diese Funktion wurde um die synaptischen Zink-Muster in verschiedenen kortikalen Regionen offenbaren ausgeschöpft und synaptischen Zink Histochemie wurde in einer Reihe von Studien verwendet. Eine Teilmenge der glutamatergen Neuronen in der Großhirnrinde enthalten Zink in die präsynaptischen Vesikel innerhalb ihrer Axon Klemmen3,4. Histochemische Untersuchungen ergaben eine heterogene Verteilung der synaptischen Zink in der Großhirnrinde5,6,7. Es scheint eine andere areal und flächige Verteilung der histochemically reaktive Zink in unterschiedlichen kortikalen Regionen (z.B., visuellen und somatosensorischen Cortex) oder Schichten (z.B.Zink-Spiegel in den Supragranular und Infragranular Schichten der primären visuellen Cortex sind wesentlich höher als in Thalamocortical Eingabeebene IV mit relativ niedrigen synaptischen Zinkspiegel)5,8,9. Die Heterogenität in der synaptischen Zink Färbung beobachtet im Kortex ist besonders vorteilhaft, da es areal und laminar Identifizierung erleichtert.
Hier präsentieren wir Ihnen eine detaillierte Beschreibung eines synaptischen Zink histochemische Verfahrens eine modifizierte Version des Danschers 1982 Methode10 ist. Diese Methode nutzt Selenit intraperitoneal injiziert (IP) in Tiere als ein Chelatbildner. Der Selenit reist zum Gehirn reagieren mit Pools von freien Zink in Vesikeln mit einer Teilmenge der glutamatergen Synapsen im Gehirn gefunden. Diese Reaktion liefert einen Niederschlag, der anschließend durch Silber Entwicklung2,10,11gesteigert werden kann.
Dieses Verfahren zeigt laminar und räumlichen Muster der synaptischen Zink Färbung; densitometrische Analysen kann verwendet werden, um diese Muster im Erwachsenen- und unreifen Gehirn Studie zu Auswirkungen von anderen Interventionen, wie sensorische, Umwelt, pharmakologische oder genetische Manipulationen sowohl qualitativ als auch quantitativ zu bewerten. Darüber hinaus kann man auch mögliche Entwicklungs Veränderungen in der Verteilung der synaptischen Zink in anderen kortikalen und subkortikalen Strukturen in anderen Modellsystemen bewerten wollen. Die quantitative Angaben, die densitometrische Analysen in dieser Methode bietet kann für folgende Entwicklung des Gehirns im Laufe der Zeit vorteilhaft sein. Dieses Protokoll stellt eine Ergänzung zu anderen Immuno und histochemische Marker um laminar und räumlichen Grenzen hinweg sichtbar zu machen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorliegende Studie beschäftigt eine histochemische Technik basiert auf einer geänderten Version des Danscher (1982) Methode10, wobei synaptischen Zink Lokalisierung erkannt und im Gehirn sichtbar gemacht werden kann. Diese Methode funktioniert im Wesentlichen durch die Injektion des Tieres mit dem Zink Chelator Natriumselenit (Na2SeO-3) (15 mg/kg). Nach Injektion der Selenit reist zum Gehirn und bindet sich an freie Zink, die zur präsynaptischen Vesikel von Zink mit Ne…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Center für Forschungsmittel (2G12RR03060-26A1); Das National Institute on Minderheit Gesundheit und gesundheitliche Ungleichheiten (8G12MD007603-27) von den National Institutes of Health; Professional Personal Kongress-City University of New York (PSC-CUNY); und Faculty Research Grant (BRD II) American University of Sharjah. Wir danken Vidyasagar Sriramoju für die Einführung von uns, diese Methoden.
Materials
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
Referências
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm’s sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
