Uso de Zinc sináptica histoquímica para revelar las diferentes regiones y láminas en el cerebro en desarrollo y adulto
Summary
Describimos un procedimiento histoquímico que revela características zinc laminar y areal manchas patrones en regiones diferentes del cerebro. El patrón de coloración de zinc puede utilizarse en conjunto con otros marcadores anatómicos distinguir confiablemente las capas y regiones en el cerebro en desarrollo y adultos.
Abstract
Caracterización de la organización anatómica y funcional del cerebro y desarrollo requiere la identificación precisa de circuitos neuronales distintos y regiones en el cerebro inmaduro y adulto. Aquí describimos un procedimiento de tinción histoquímica de cinc que revela las diferencias en los patrones de tinción entre los diferentes estratos y regiones del cerebro. Otros han utilizado este procedimiento no sólo para revelar la distribución de las neuronas que contienen cinc y circuitos en el cerebro, sino también para delinear correctamente límites areal y laminares en el cerebro en desarrollo y adultos en varias especies. Aquí ilustramos esto procedimiento con imágenes del desarrollo de la coloración y los cerebros de adultos ferret. Revelan un patrón de coloración de zinc que sirve como un marcador anatómico de las zonas y capas y puede usarse confiablemente para distinguir áreas visuales corticales en la corteza visual en desarrollo y adultos. El objetivo principal de este protocolo es presentar un método histoquímico que permite la identificación exacta de las capas y regiones en el cerebro en desarrollo y adultos donde otros métodos no lo hacen. En segundo lugar, en combinación con el análisis densitométrico de la imagen, este método permite evaluar la distribución de zinc sináptica para revelar posibles cambios a lo largo de desarrollo. Este protocolo describe en detalle los reactivos, herramientas y pasos necesarios para teñir sucesivamente secciones del cerebro congelado. Aunque este protocolo es descrito usando tejido de cerebro de ferret, fácilmente puede ser adaptado para su uso en roedores, gatos o monos, así como en otras regiones del cerebro.
Introduction
Manchas histológicas se han utilizado tradicionalmente para ayudar en la identificación de áreas corticales en varias especies por revelar las diferencias en características arquitectónicas. El uso combinado de técnicas histoquímicas como gránulos de Nissl, citocromo oxidasa (CO) reactividad o mielina puede resultar fructífero como revelan límites áreas similares en el cerebro adulto. Sin embargo, estas manchas histoquímicas no revelan siempre adecuadamente límites claros entre áreas corticales y las capas del cerebro inmaduro.
En el sistema nervioso central, zinc tiene varias funciones esenciales que incluyen estabilización de la estructura del ADN, actuando como un cofactor enzimático, participa en numerosas funciones reguladoras y actúan como un neuromodulador a través de su presencia en vesículas sinápticas 1. zinc sináptica es única ya que puede visualizarse mediante métodos histológicos, mientras que el cinc protein-bound se puede visualizar2. Esta característica ha sido aprovechada para revelar el patrón de cinc sináptica en diferentes regiones corticales, e histoquímica de zinc sináptica se ha utilizado en varios estudios. Un subconjunto de neuronas glutamatérgica en la corteza cerebral contiene zinc en las vesículas presinápticas en su axon terminales3,4. Estudios histoquímicos han revelado una distribución heterogénea de zinc sináptica en la corteza cerebral5,6,7. Parece haber una distribución areal y laminar diferentes de zinc histochemically reactiva en diferentes regiones corticales (p. ej., visual y Corteza somatosensorial), o en capas (por ejemplo, los niveles de zinc en el supragranular y infragranular capas de la corteza visual primaria son substancialmente más altas que en la capa de entrada talamocorticales IV con niveles relativamente bajos de zinc sináptica)5,8,9. La heterogeneidad en zinc sináptica la coloración observada en la corteza es especialmente ventajosa como facilita la identificación areal y laminar.
Aquí presentamos una descripción detallada de un procedimiento histoquímico de zinc sináptica, que es una versión modificada del Danscher 1982 método10. Este método utiliza selenio inyectado por vía intraperitoneal (IP) en los animales como un agente quelante. La selenita viaja al cerebro a reaccionar con piscinas de zinc libre encuentran en las vesículas de un subconjunto de las sinapsis glutamatérgica en el cerebro. Esta reacción produce un precipitado que se puede ampliar posteriormente el desarrollo plata2,10,11.
Este procedimiento revela patrones laminares y areal de tinción sináptica zinc. Análisis densitométricos pueden utilizarse para evaluar estos patrones cualitativa y cuantitativamente en el cerebro adulto y no maduro para estudiar efectos de otras intervenciones, como manipulaciones sensoriales, ambientales, farmacológicas o genéticas. Además, uno también puede desear evaluar potenciales cambios de desarrollo en la distribución de zinc sináptica en otras estructuras corticales o subcorticales en otros sistemas del modelo. La información cuantitativa que proporciona análisis densitométrico en este método puede ser ventajosa para el siguiente desarrollo del cerebro en el tiempo. Este protocolo proporciona un compañero y otras inmuno – marcadores histoquímicos para revelar los límites laminares y areal.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente estudio emplea una técnica histoquímica basada en una versión modificada de la Danscher (1982) método10, por el que localización sináptica cinc puede ser detectado y visualizado en el cerebro. Esencialmente, este método funciona mediante la inyección el animal con el selenito de sodio quelante cinc (Na2SeO3) (15 mg/kg). Después de la inyección, la selenita viaja al cerebro y se une al zinc libre que se localiza en las vesículas presinápticas de zinc qu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del centro nacional para recursos de investigación (2G12RR03060-26A1); El Instituto Nacional de salud de minorías y disparidades en la salud (8G12MD007603-27) de los institutos nacionales de salud; Profesional personal Universidad de Congreso-ciudad de Nueva York (PSC-CUNY); y Facultad investigación Grant (RFA II) de la Universidad Americana de Sharjah. Agradecemos a Vidyasagar Sriramoju para introducirnos a estos métodos.
Materials
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
Referências
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