मानव Mitochondrial डीएनए में Ribonucleotides की एक साथ मैपिंग और Quantitation
Summary
यहाँ हम एक साथ एक ही quantitate और जीनोम चौड़ा नक्शा ribonucleotides में अत्यधिक बरकरार डीएनए में एक-न्यूक्लियोटाइड संकल्प के लिए उत्तरदायी विधि का वर्णन, अपने alkaline जीनोमिक और बाद में 5 hydrolysis के अंत के साथ ´ डीएनए के एंजाइमी दरार के संयोजन अनुक्रमण.
Abstract
एक जीनोम में मौजूद ribonucleotides की संख्या का अनुमान करने के लिए स्थापित दृष्टिकोण लघु सिंथेटिक डीएनए टुकड़े या plasmids के रूप में ribonucleotides का उपयोग कर शामिल की quantitation तक ही सीमित हैं और फिर पूरे करने के लिए परिणाम extrapolating जीनोम. वैकल्पिक रूप से, एक जीनोम में मौजूद ribonucleotides की संख्या alkaline जैल या दक्षिणी दाग का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है । अधिक vivo दृष्टिकोण में हाल ही में अगले पीढ़ी ribonucleotides के जीनोम-वाइड मानचित्रण, स्थिति और एंबेडेड ribonucleotides की पहचान प्रदान करने की अनुमति अनुक्रमण काम । हालांकि, वे ribonucleotides जो एक जीनोम में शामिल कर रहे है की संख्या के quantitation की अनुमति नहीं है । यहां हम कैसे एक साथ नक्शा और ribonucleotides जो मानव mitochondrial डीएनए में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा vivo में शामिल कर रहे है की संख्या quantitate का वर्णन । हम अत्यधिक बरकरार डीएनए का उपयोग करें और यह एक endonuclease के साथ पचा द्वारा अनुक्रम विशिष्ट डबल किनारा टूटता परिचय, बाद में क्षार के साथ ribonucleotides शामिल hydrolyzing । जनरेट किया गया समाप्त होता है एडेप्टर के साथ ligated और इन सिरों पर एक अगली पीढ़ी sequencing मशीन अनुक्रम हैं । ribonucleotides की निरपेक्ष संख्या अनुक्रम विशिष्ट endonuclease के लिए मान्यता साइट पर पढ़ता की औसत संख्या प्रति मान्यता साइट के बाहर पढ़ता की संख्या के रूप में परिकलित किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल को भी नक्शा और डीएनए में quantitate मुक्त निक का उपयोग किया जा सकता है और अनुकूलन के लिए अंय डीएनए घावों कि 5 ´ को संसाधित किया जा सकता है नक्शा करने की अनुमति देता है-ओह समाप्त होता है या 5 ´-फास्फेट समाप्त होता है । इसके अलावा, इस विधि किसी भी जीव को लागू किया जा सकता है, यह देखते हुए कि एक उपयुक्त संदर्भ जीनोम उपलब्ध है । इस प्रोटोकॉल इसलिए डीएनए प्रतिकृति, 5 ´-अंत प्रसंस्करण, डीएनए क्षति, और डीएनए की मरंमत का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है ।
Introduction
एक युकेरियोटिक कोशिका में, ribonucleotides (rNTPs) की एकाग्रता deoxyribonucleotides (dNTPs)1की एकाग्रता की तुलना में बहुत अधिक है । डीएनए ribonucleotides के खिलाफ भेदभाव polymerases, लेकिन यह भेदभाव सही नहीं है और, एक परिणाम के रूप में, ribonucleotides के बजाय deoxyribonucleotides डीएनए प्रतिकृति के दौरान जीनोम में शामिल किया जा सकता है । Ribonucleotides सबसे आम गैर-विहित न्यूक्लियोटाइड जीनोम में शामिल किया जा सकता है2। इन ribonucleotides से अधिकांश Okazaki टुकड़ा परिपक्वता के दौरान RNase H2 शुरू ribonucleotide उत्पाद शुल्क मरंमत (RER) द्वारा या तोपोइसोमेरसे 1 (संदर्भ में समीक्षित3) हटा रहे हैं । Ribonucleotides कि हटाया नहीं जा सकता है छुरा डीएनए2,4 में शामिल किया है और यह दोनों हानिकारक और लाभप्रद तरीके में प्रभावित (समीक्षा की समीक्षा की5में) हो सकता है । इसके अलावा सकारात्मक संकेतों के रूप में कार्य करने में सक्षम किया जा रहा है, उदाहरण के लिए में संभोग प्रकार स्विच में Schizosaccharomyces pombe6 और बेमेल मरंमत के दौरान नवजात डीएनए किनारा अंकन (एमएमआर)7,8, ribonucleotides को प्रभावित संरचना9 और आसपास के 2 ´-हाइड्रॉक्सिल समूह के कारण डीएनए की स्थिरता उनके ribose10, प्रतिकृति तनाव और जीनोम अस्थिरता में जिसके परिणामस्वरूप11. जीनोमिक डीएनए में ribonucleotides की बहुतायत (gDNA) और प्रतिकृति और मरंमत तंत्र में उनकी प्रासंगिकता, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीनोम स्थिरता के लिए निहितार्थ, कारण उनके सटीक घटना और एक जीनोम में व्यापक तरीके से आवृत्ति की जांच दे ।
RNase H2 गतिविधि मानव mitochondria में नहीं पाया गया है और ribonucleotides इसलिए कुशलतापूर्वक mitochondrial डीएनए (mtDNA) में नहीं हटा रहे हैं । कई रास्ते मानव mitochondria को न्यूक्लियोटाइड की आपूर्ति में शामिल है और जांच करने के लिए कि mitochondrial न्यूक्लियोटाइड पूल में गड़बड़ी मानव ribonucleotides में mtDNA का एक ऊंचा संख्या का कारण है, हम नक्शे और quantitate के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित मानव mtDNA में ये ribonucleotides fibroblasts, हेला कोशिकाओं, और रोगी कोशिका लाइनों12से पृथक ।
इन विट्रो में अधिकांश दृष्टिकोण (समीक्षा13में) डीएनए polymerases ‘ selectivity के खिलाफ rNTPs का निर्धारण करने के लिए एकल ribonucleotide प्रविष्टि या प्राइमर विस्तार प्रयोगों पर आधारित है जहां प्रतिस्पर्धा rNTPs प्रतिक्रिया में शामिल हैं मिश्रण, कम डीएनए में पहचान या ribonucleotide निगमन के रिश्तेदार quantitation टेंपलेट्स की अनुमति । कम दृश्यों पर मात्रात्मक दृष्टिकोण dNTP और rNTP पूल सेलुलर सांद्रता पर प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है और इसलिए पोलीमरेज़ selectivity में अंतर्दृष्टि प्रदान लेकिन सीमित पूरे जीनोम के बारे में महत्व के हैं । यह दिखाया गया है कि एक लंबे समय तक डीएनए टेम्पलेट, जैसे एक प्लाज्मिड, की प्रतिकृति के दौरान शामिल ribonucleotides की सापेक्ष मात्रा radiolabeled dNTPs का उपयोग कर एक sequencing जेल पर visualized किया जा सकता और एक क्षारीय hydrolyzing में डीएनए वातावरण14. इसके अलावा, gDNA दक्षिणी दाग पर क्षारीय hydrolysis निंनलिखित विश्लेषण किया गया है, कतरा-विशिष्ट जांच और vivo15में ribonucleotide निगमन की निरपेक्ष दरों के निर्धारण की अनुमति । इन दृष्टिकोणों निगमन आवृत्ति के एक रिश्तेदार की तुलना लेकिन स्थिति या शामिल ribonucleotides की पहचान में कोई अंतर्दृष्टि देने की अनुमति देते हैं । HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, पु-Seq18, या emRiboSeq19, जैसे vivo मेंgDNA में ribonucleotide सामग्री का विश्लेषण करने के लिए नवीनतम approaches एंबेडेड ribonucleotides का लाभ उठाएं ‘ क्षारीय या RNase H2 उपचार के लिए संवेदनशीलता, क्रमशः, और ribonucleotides जीनोम चौड़ा की पहचान करने के लिए अगली पीढ़ी अनुक्रमण को रोजगार । इन विधियों का पता लगाया ribonucleotides के निरपेक्ष शामिल आवृत्ति में अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते । HydEn-seq प्रोटोकॉल के अनुक्रम विशिष्ट एंजाइमी दरार के कदम जोड़कर, विधि हम यहाँ का वर्णन आसानी से जानकारी एक अनुक्रमण दृष्टिकोण से प्राप्त फैली हुई है, एक साथ मानचित्रण और quantitation की अनुमति एम्बेडेड ribonucleotides12. इस पद्धति को वस्तुतः किसी भी जीव दिया है कि अत्यधिक बरकरार डीएनए निष्कर्षों और उत्पंन किया जा सकता है एक उपयुक्त संदर्भ जीनोम उपलब्ध है लागू है । विधि quantitate के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और किसी भी घाव है कि एक nuclease द्वारा पचा जा सकता है और एक 5 ´-फॉस्फेट या एक 5 ´-ओह अंत पत्ते के स्थान का निर्धारण ।
मैप करने के लिए और जीनोमिक डीएनए में ribonucleotides quantitate, विधि एक अनुक्रम विशिष्ट endonuclease द्वारा दरार को जोड़ती है और क्षारीय hydrolysis 5 ´-फास्फेट साइटों पर समाप्त होता है जहां endonuclease के लिए विशिष्ट मान्यता अनुक्रम स्थित है और 5 ´- ओह, जहां ribonucleotides स्थित थे पदों पर समाप्त होता है । के बाद से उत्पंन मुक्त समाप्त होता है बाद एडेप्टर के साथ ligated और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग अनुक्रम, यह महत्व का है अत्यधिक बरकरार डीएनए का उपयोग करें और डीएनए निष्कर्षण और पुस्तकालय की तैयारी के दौरान यादृच्छिक विखंडन से बचें । इन पढ़ता का आकलन करने के लिए सामान्यीकृत endonuclease दरार साइटों पर पढ़ता एक साथ quantitation और पता लगाया ribonucleotides के मानचित्रण की अनुमति देता है. नि: शुल्क 5 ´-सिरों नियंत्रण प्रयोगों में पता चला है जहां डीएनए के क्षारीय hydrolysis KCl के साथ इलाज के द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है । अधिग्रहीत डेटा ribonucleotide स्थान और मात्रा में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और ribonucleotide सामग्री और निगमन आवृत्ति के संबंध में विश्लेषण की अनुमति देता है.
Protocol
इस प्रोटोकॉल चित्रा 1 में उल्लिखित है और gDNA का अलगाव शामिल है, प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पाचन quantitate की संख्या ribonucleotides करने के लिए सक्षम होना करने के लिए, क्षार के साथ उपचार hydrolyze में शामिल ribonucleotides के phosphodiester बांड gDNA, फास्फारिलीकरण of free 5 & #180;-ओह समाप्त होता है, ssDNA बंधाव एडेप्टर की, दूसरा किनारा संश्लेषण, और पीसीआर प्रवर्धन से पहले अनुक्रमण ।
1. एडेप्टर्स और इंडेक्स प्राइमर्स प्राप्त ARC49, ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, अनुकूलक और ARC78-ARC107 इंडेक्स प्राइमर्स (देखें Table 1 ). नोट: Oligonucleotides को HPLC शुद्धि करनी चाहिए । ARC76/77 द्वैध के रूप में आदेश दिए हैं । तैयार १०० & #181; मी स्टॉक समाधान Tris-EDTA (TE) में प्रत्येक oligonucleotide का बफर ( तालिका देखें सामग्री ) और स्टोर पर-20 & #176; C. तैयार 10 & #181; क ARC67/77 और 2 & #181 के m समाधान; ARC49 और इंडेक्स प्राइमरों के रेफरेंस बफर में कमजोर के द्वारा मैसर्स सॉल्यूशन (EB; टेबल देखें ) । Store at-20 & #176; C.
2. कोशिकाओं की वृद्धि और फसल ७० मिलीलीटर में हेला कोशिकाओं को विकसित Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) एक २५० मिलीलीटर स्पिनर कुप्पी में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक ३७ & #176; C. कोशिकाओं की संख्या की गणना और एक ५०-एमएल ट्यूब में 5×10 6 कोशिकाओं को इकट्ठा, २०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक, और supernatant त्यागें । 20 मिलीलीटर 1x पंजाबियों के साथ कोशिकाओं धो, २०० x g पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक, और supernatant. त्यागें पर छर्रों फ्रीज-20 & #176; सी या डीएनए शुद्धि के साथ जारी रखें ।
3. डीएनए शुद्धि और Quantitation शुद्ध gDNA का उपयोग phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के रूप में नीचे वर्णित है । 2 मिलीलीटर lysis बफर में कोशिकाओं reसस्पेंड (सामग्री की तालिका देखें) और ४२ & #176 पर 30 मिनट के लिए मशीन एक हीटिंग ब्लॉक पर सी । चेतावनी: Lysis बफर खतरनाक घटक होते हैं । एसडीएस समाधान परेशान है, Proteinase कश्मीर संवेदनशील, परेशान है, और विषाक्त । सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने पहनें । दो 2 मिलीलीटर ट्यूबों में नमूना विभाजित है और phenol-क्लोरोफॉर्म-isoamyl शराब (25:24:1) के 1 खंड (वी) जोड़ें । चेतावनी: Phenol-क्लोरोफॉर्म-isoamyl शराब विषाक्त, mutagenic, संक्षारक, और जलीय वातावरण के लिए खतरनाक है । एक धुएं डाकू में प्रयोग करें, सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने पहनते हैं, और विशेष phenol-क्लोरोफॉर्म अपशिष्ट में त्यागें । 30-60 एस के लिए उलटा द्वारा मिश्रण और कमरे के तापमान पर १५,००० एक्स जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । नोट: भंवर डीएनए यादृच्छिक किनारा टूट जाता है, जो परिणाम विकृत होगा शुरू करने से बचने के लिए नहीं है । एक नया 2 एमएल ट्यूब करने के लिए ऊपरी, जलीय चरण हस्तांतरण और phenol-क्लोरोफॉर्म-isoamyl शराब (25:24:1) के 1 V जोड़ें । मिश्रण और 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर १५,००० x g पर 4 & #176; C. स्थानांतरण ऊपरी, जलीय चरण एक नई 2 एमएल ट्यूब करने के लिए और जोड़ें 20 & #181; L NaCl (5 मी) और शीत isopropanol के 1 वी. चेतावनी: Isopropanol ज्वलनशील, परेशान है, और विषाक्त । यह एक हवादार कैबिनेट में स्टोर, सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने पहनते हैं, और यह आग की लपटों से दूर रखने के लिए । मिश्रण से उलटा और एक कम 1 ज के लिए मशीन पर-20 & #176; ग. १५,००० x g पर 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक, 4 & #176; C और त्याग supernatant. धो डीएनए गोली के साथ २०० & #181; L शीत ७०% इथेनॉल, पर 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक १५,००० x g पर 4 & #176; C और छोड़ें supernatant. चेतावनी: ७०% इथेनॉल ज्वलनशील और परेशान है । कार्य समाधान रखें at-20 & #176; C, अंयथा हवादार कैबिनेट में स्टोर, सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने पहनते हैं, और यह आग की लपटों से दूर रखने के लिए । 20-25 min. के लिए कमरे के तापमान पर डीएनए गोली सूखी १०० में डीएनए छर्रों भंग & #181; L ते बफर और पूल नमूने एक ट्यूब में. Quantitate डीएनए एकाग्रता का प्रयोग कर एक dsDNA quantitation रिएजेंट के अनुसार निर्माता & #39; s विनिर्देशों ( सामग्री की तालिका देखें ). नोट: dsDNA quantitation रिएजेंट का प्रयोग करें, क्योंकि स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक डीएनए quantitation अवशिष्ट phenol से प्रभावित हो सकते हैं । स्टोर DNA at-20 & #176; C या HincII उपचार के साथ जारी रखें.
4. HincII उपचार और क्षार Hydrolysis डाइजेस्ट 1 & #181; डीएनए के g लए एक अभिक्रिया मिश्रण जिसम 5 & #181; l 10x बफर ३.१, 1 & #181; l (10 यू) HincII, व nuclease-इव H 2 O को अंतिम खंड ५० & #181; l. नोट: बंधाव, दूसरा किनारा संश्लेषण और पीसीआर प्रवर्धन के लिए इष्टतम शर्तों को प्राप्त करने के लिए, यह इनपुट डीएनए की मात्रा में वृद्धि करने के लिए आवश्यक हो सकता है अगर यह उम्मीद है कि डीएनए ribonucleotides की एक बहुत कम संख्या में शामिल हैं. इसी तरह, यदि ribonucleotides की संख्या बहुत अधिक है तो इनपुट डीएनए में कमी करना आवश्यक हो सकता है । ३७ & #176 पर 30 मिनट के लिए मशीन; C. paramagnetic मोतियों के साथ डीएनए HincII इलाज शुद्ध । नोट: ट्यूब को खोल कर छर्रों को परेशान नहीं करने के लिए निम्नलिखित चरणों में खुले रखें. प्रत्येक नमूने के लिए paramagnetic मोतियों की १.८ V जोड़ें, ध्यान से pipetting द्वारा मिश्रण, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी. 5 मिनट के लिए मोतियों की गोली के लिए एक चुंबकीय रैक का उपयोग करें, तो निकालें और supernatant. त्यागें धोने के साथ गोली १५० & #181; एल के ७०% इथेनॉल के बारे में 30 एस के लिए (कमरे के तापमान) फिर निकालें और supernatant. धोने के साथ गोली २०० & #181; एल के ७०% इथेनॉल के बारे में 30 एस के लिए (कमरे के तापमान) फिर निकालें और supernatant. नोट: अवशिष्ट इथेनॉल को 10 & #181 के साथ निकाला जा सकता है; L पिपेट. बूंदों नीचे संक्षेप में पहले से काता जा सकता है । 15-20 मिनट के आसपास के लिए कमरे के तापमान पर नमूने सूखी नोट: सटीक समय मोतियों की मात्रा और गोली के आकार पर निर्भर करता है, इसलिए छर्रों नेत्रहीन की जाँच की जानी चाहिए. ४५ में चुंबकीय रैक और elute गोली से ट्यूबों निकालें & #181; L EB, pipetting जतन करके मिश्रण. 5 मिनट के लिए मशीन तो चुंबकीय रैक पर मोतियों की गोली और ४५ & #181 का उपयोग करें; L चरण ४.४ में शुद्ध डीएनए के एल. Add 5 & #181; एल ऑफ कोह (3 एम) या KCl (3 एम) की कुल मात्रा बनाने वाले डीएनए को ५० & #181; l. चेतावनी: 3 एम KOH समाधान संक्षारक है । सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने पहनें । में 2 ज के लिए ५५ & #176; C एक संकरण ओवन में बर्फ पर 5 मिनट के बाद । नोट: यह ट्यूब के एक समान हीटिंग को बनाए रखने और ढक्कन पर रोक लगाने के लिए एक हीटिंग ब्लॉक के बजाय एक ओवन में KOH उपचार प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है । हाला DNA को जोड़कर 10 & #181; l सोडियम एसीटेट (3 M, pH = ५.२) और १२५ & #181; L शीत १००% इथेनॉल. 5 min. के लिए बर्फ पर मशीन चेतावनी: १००% इथेनॉल ज्वलनशील और परेशान है । एक हवादार कैबिनेट में स्टोर, सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने पहनते हैं, और आग की लपटों से दूर रहते हैं । गोली gDNA द्वारा २१,००० x g पर, 4 & #176; C 5 मिनट के लिए और supernatant. त्यागें धो डीएनए गोली के साथ २५० & #181; L शीत ७०% ेतोः, पर केंद्रापसारक २१,००० x g, 4 & #176; C 5 मिनट के लिए, और supernatant. को त्यागें नोट: बूंदों को हटाने के लिए, ट्यूब को संक्षेप में फिर से नीचे प्रकाता किया जा सकता है और supernatant को 10 & #181 के साथ हटाया जा सकता है; l पिपेट. के बारे में 5-10 मिनट के लिए एक खुली ट्यूब में गोली सूखी चलो जब तक किसी भी दिखाई द्रव काफूर हो गया है । चलो डीएनए गोली भंग में 20 & #181; एल EB कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए.
5 .5 & #180; समा फास्फारिलीकरण अग्रिम विपक्ष में प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण तैयारisting of २.५ & #181; l 10x टी-4 polynucleotide कळेनासे प्रतिक्रिया बफर, 1 & #181; l (10 यू) 3 & #180;-फॉस्फेट-ऋण टी-4 polynucleotide कळेनासे, और २.५ & #181; l एटीपी (10 मि.). का स्थानान्तरण 19 & #181; l येक डीएनए नमूने का एक नया २०० & #181; एल ट्यूब और प्रकृति के लिए 3 मिन पर ८५ & #176; सी में एक थर्मामीटर-साइकिल चालक । बर्फ पर शांत डीएनए नमूने और जोड़ 6 & #181; प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण का एल. की मशीन प्रतिक्रिया घोला जा सकता है पर ३७ & #176; सी के लिए 30 मिनट और ६५ पर नमूनों की मशीन द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो & #176; c for 20 min. ४.३ में वर्णित डीएनए को शुद्ध करें, paramagnetic मोतियों की १.८ वी का उपयोग कर रहा है लेकिन elute में 14 & #181; L EB.
6. ssDNA बंधाव ०.५ & #181 से मिलकर अग्रिम में प्रत्येक नमूने के लिए रिएक्शन मिश्रण तैयार करें; l एटीपी (2 मिमी), 5 & #181; एल 10x टी-4 आरएनए ligase रिएक्शन बफर, 5 & #181; l CoCl 3 (NH 3 ) 6 (10 मि.), ०.५ & #181; l ARC140 (१०० & #181; M), व 25 & #181; L ५०% खूंटी ८०००. pipetting. द्वारा अच्छी तरह मिलाएं सावधानी: CoCl 3 (NH 3 ) 6 यलो, संवेदी, और जलीय पर्यावरण के लिए खतरनाक है । सुरक्षात्मक कपड़े और दस्ताने पहनें । Transfer 13 & #181; l शुद्ध डीएनए के चरण ५.५ से एक नया २०० & #181; एल ट्यूब और प्रकृति के लिए 3 मिन पर ८५ & #176; सी में एक थर्मामीटर-साइकिल चालक । आइस पर डीएनए ठंडा और जोड़ें ३६ & #181; प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण के एल, pipetting द्वारा मिश्रण, और संक्षेप में नीचे स्पिन. जोड़ 1 & #181; टी-4 आरएनए के एल (10 यू) प्रत्येक प्रतिक्रिया करने के लिए Ligase, pipetting द्वारा मिश्रण, और संक्षेप में नीचे स्पिन. रात के अंधेरे में कमरे के तापमान पर नमूने की मशीन ।
7. दूसरा किनारा संश्लेषण शुद्ध ligated डीएनए के रूप में ४.३ में वर्णित है, लेकिन उपयोग ०.८ paramagnetic मोतियों का वी, गोली के लिए मोती 10 मिनट और elute में 20 & #181; L EB. नोट: बंधाव प्रतिक्रिया मिश्रण की उच्च चिपचिपापन के कारण, पहली गोली कदम लंबे समय तक है । Transfer 20 & #181; l को डीएनए सैंपल का एक नया २०० & #181; l पीसीआर ट्यूब. शुद्धिकरण चरण को दोहराएं paramagnetic मोतियों के ०.८ वी का उपयोग कर निर्माता & #39; s विनिर्देशों और elute में 14 & #181; L EB. 2 & #181 से मिलकर अग्रिम में प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार; l के 10x T7 डीएनए पोलीमरेज़ प्रतिक्रिया बफर, २ & #181; L ARC76/77 (2 & #181; M), 2 & #181; l dNTPs (2 मि.), व ०.८ & #181; l BSA (1 mg/एमएल). Transfer १२.८ & #181; l शुद्ध डीएनए एक नया २०० & #181; एल ट्यूब, 3 मिन के लिए प्रकृति ८५ & #176 पर एक थर्मामीटर-साइकिल चालक में सी. आइस पर डीएनए को ठंडा करें और जोड़ें ६.८ & #181; प्रतिक्रिया मिश्रण के प्रत्येक नमूने के लिए एल, pipetting द्वारा मिश्रण, संक्षेप नीचे स्पिन, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन । Add ०.४ & #181; L (4 उ) T7 डीएनए प्रत्येक प्रतिक्रिया करने के लिए पोलीमरेज़ और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन । ४.३ में वर्णित डीएनए को शुद्ध करें, paramagnetic मोतियों की ०.८ वी का उपयोग कर और elute 11 & #181; L EB.
8. पीसीआर प्रवर्धन और पुस्तकालय Quantitation एक नया २०० & #181 में प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार; एल ट्यूब पहले से मिलकर ७.५ & #181; l ARC49 (2 & #181; M), ७.५ & #181; l इंडेक्स प्राइमरी (2 & #181; एम, प्रत्येक नमूने के लिए अद्वितीय), और 25 & #181; l 2x गरम शुरू तैयार mix. Add 10 & #181; प्रत्येक प्रतिक्रिया को डीएनए सैंपल के एल. निम्न स्थितियों का उपयोग करके लाइब्रेरी बढ़ाना: विस्वभाव ९५ & #176; ग के लिए ४५ s, इसके बाद 18 चक्र के ९८ & #176; ग के लिए 15 एस, ६५ & #176; ग के लिए 30 एस, ७२ & #176; ग 30 एस के लिए, ७२ & #176 पर एक अंतिम बढ़ाव के साथ समाप्त होने के लिए c 2 min. 4 & #176 पर नमूने दबाए रखें; ग फाद प्रवर्धन क ֩ ४.३ में वर्णित के रूप में पुस्तकालयों को शुद्ध, paramagnetic मोतियों की ०.८ वी का उपयोग कर, और elute में 20 & #181; L ते बफर. Quantitate पुस्तकालयों का उपयोग कर एक dsDNA quantitation रिएजेंट, के अनुसार निर्माता & #39; s विनिर्देशों ( सामग्री की तालिका देखें ). Store samples at-20 & #176; C या लायब्रेरी विश्लेषण के साथ जारी रखें ।
9. पुस्तकालय विश्लेषण और पूलिंग प्रत्येक लाइब्रेरी की गुणवत्ता निर्धारित करें और डिजिटल ट्रो सिस्टम का उपयोग करके औसत अंश आकार का अनुमान लगाएँ. नोट: औसत अंश आकार का आकलन करके मूल्यांकन किया जाता है, जहां electropherogram के वक्र के अंतर्गत क्षेत्र, मार्करों से चोटियों की अवहेलना करते हुए आधा होता है । कोह या KCl उपचार के बाद उपयुक्त पुस्तकालय प्रोफाइल के प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2a . के रूप में पुस्तकालयों के एकाग्रता (एनएम) की गणना: (c/10 3 )/(p * 650)] * 10 9 जहां c के एनजी में पुस्तकालय की एकाग्रता है/& #181; एल और पी बीपी में औसत टुकड़ा आकार है, के रूप में ९.१ में अनुमानित । पूल अप करने के लिए 24 अनुक्रमण के लिए विभिंन सूचकांक प्राइमरों के साथ परिलक्षित पुस्तकालयों के बराबर दाढ़ मात्रा में । किसी अंतिम वॉल्यूम के लिए ते बफ़र जोड़ें 25 & #181; L और 10 एनएम की एकाग्रता. नोट: के आधार पर पुस्तकालयों की संख्या को परित, प्रत्येक पुस्तकालय से डीएनए की मात्रा समायोजित है । यदि प्राइमरी dimers के बारे में १३० बीपी की एक अलग चोटी के रूप में कदम ९.१ में पाया गया, पुस्तकालय पूल की अंतिम मात्रा 25 & #181 से अधिक हो सकती है; l, क्योंकि शुद्धिकरण चरण ४.३ में वर्णित के रूप में दोहराया जाता है, paramagnetic मोतियों का ०.८ V का उपयोग कर, और डीएनए 25 & #181 में eluted है; l ते बफ fer. निर्माता & #39; s विनिर्देशों और ऊपर वर्णित के रूप में औसत चोटी के आकार के अनुसार एक dsDNA quantitation एजेंट का उपयोग कर नई लाइब्रेरी पूल एकाग्रता का निर्धारण । sequencing और डेटा विश्लेषण (अनुभाग 10 और 11) के लिए आगे बढ़ें ।
10. sequencing निष्पादित ७५-आधार युग्मित-end अनुक्रमणित पर pooled पुस्तकालयों १२ .
11. डेटा विश्लेषण ट्रिम कर दीजिए सभी पढ़ता एडाप्टर अनुक्रम को हटाने के लिए, गुणवत्ता के लिए फ़िल्टर और लंबाई पढ़ें. नोट: यह cutadapt का उपयोग कर किया जा सकता है 1.2.1 २० विथ कमांड ‘ cutadapt-एफ fastq–मैच-पढ़े-वाइल्डकार्ड्स–वैराग्य-m 15-q 10-a NNNNNNN & #60; फाइल & #62; ‘, जहां NNNNNNN वास्तविक एडेप्टर अनुक्रम से बदला गया है और & #60; फाइल & #62; है fastq फ़ाइल नाम से प्रतिस्थापित. कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग कर पिछले चरण में छोड़ दिया गया पढ़ता के साथियों को निकालें । एक सूचकांक में सभी oligonucleotides पुस्तकालय की तैयारी में प्रयुक्त ( जैसे, का उपयोग Bowtie 0.12.8 21 और कमांड लाइन विकल्प-m1-v2) के लिए शेष जोड़े के मेट 1 संरेखित करें । सफल संरेखणों के साथ सभी जोड़ों को छोड़ें । जीव संदर्भ जीनोम कमांड लाइन विकल्प के साथ Bowtie का उपयोग करने के लिए शेष जोड़े संरेखित-v2-X10000-best. नक्शा पढ़ता है कि mitochondrial अणु शुरुआत के बीच अवधि और अंत मेट 1 सभी जोड़े के संरेखण (कमांड लाइन विकल्प के साथ Bowtie का उपयोग कर-v2). 5 & #180 की गिनती निर्धारित करता है;-सभी एकल और युग्मित अंत संरेखण के लिए समाप्त होता है । एक आधार ऊपर से इन की स्थिति में बदलाव की स्थिति है जहां hydrolyzed ribonucleotides थे । आम जीनोम ब्राउज़रों में दृश्य के लिए कस्टम लिपियों का उपयोग कर एक bedgraph फ़ाइल स्वरूप को bowtie फ़ाइल स्वरूप से डेटा निर्यात करें । सामांय के लिए प्रत्येक कतरा के लिए पढ़ता है लाख प्रति पढ़ता है. की स्थिति और bedgraph फ़ाइल से मायने रखता है, संदर्भ जीव जीनोम अनुक्रम का उपयोग करने के लिए कॉर्प की पहचान निर्धारितorated ribonucleotides नोट: के लिए मानव mitochondrial जीनोम 16200 क्षेत्रों से पढ़ता है-300 और प्रत्येक कतरा के लिए 5747-5847 से बाहर रखा जाना चाहिए के बाद से इन क्षेत्रों में कई नि: शुल्क 5 & #180;-ribonucleotide शामिल करने के लिए असंबंधित समाप्त होता है द्वारा डीएनए पोलीमरेज़ & #947;. विभाजित कुल पढ़ता है, नहीं सहित ग्यारह HincII साइटों पर पढ़ता है, HincII साइट के प्रति पढ़ता की संख्या का मतलब के साथ ribonucleotides की संख्या पाने के लिए प्रति एकल किनारा तोड़, ( यानी अणु प्रति ribonucleotides की संख्या). mitochondrial
Representative Results
Discussion
यहां हम एक तकनीक वर्तमान के लिए एक साथ नक्शा और gDNA में ribonucleotides मात्रा, और विशेष रूप से mtDNA, डीएनए दरार की सरल परिचय द्वारा जीनोम में अनुक्रम विशिष्ट साइटों में स्थापित HydEn-seq प्रोटोकॉल के लिए एक अतिरिक्त के रूप में । हालांकि यह अध्ययन मानव mtDNA पर केंद्रित है, मूल रूप से HydEn-seq विधि Saccharomyces cerevisiaeमें विकसित किया गया था, अन्य जीवों के लिए विधि का अनुवाद12illustrating,16.
विश्वसनीय परिणाम इस दृष्टिकोण से प्राप्त करने के लिए, कुछ महत्वपूर्ण कदम नोट किया जाना चाहिए: (क) sequencing एडेप्टर ligate सभी उपलब्ध 5 ´-सिरों के बाद से, यह अत्यधिक बरकरार डीएनए के साथ काम करने के लिए महत्वपूर्ण है । डीएनए अलग किया जाना चाहिए और पुस्तकालयों अधिमानतः डीएनए अलगाव के बाद तुरंत किया जाना चाहिए, या डीएनए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है । यह अनुशंसित नहीं है कि लंबे समय तक डीएनए को फ्रिज में स्टोर कर कर रखें या बार में फ्रीज करके उसे गल जाए । (ख) इस विधि के साथ उपयुक्त पुस्तकालयों उत्पंन करने के लिए, यह एक मशीन ओवन में डीएनए के KOH उपचार प्रदर्शन महत्वपूर्ण है, बल्कि एक हीटिंग ब्लॉक से, पूरे नमूने और मात्रात्मक hydrolysis के समरूप हीटिंग आश्वस्त । (ग) इसके अलावा, यह पूलिंग और अनुक्रमण से पहले पुस्तकालयों की गुणवत्ता को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है । डीएनए मात्रा और एक स्वचालित ट्रो प्रणाली का उपयोग कर पुस्तकालय डीएनए की पर्याप्त मात्रा में सुनिश्चित करने के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए, उचित टुकड़ा आकार की पुष्टि करें, और प्राइमरी dimers के लिए जांच करें ।
एक सार्थक डेटा विश्लेषण के लिए, यह भी ध्यान दें कि इस विधि के जानकारीपूर्ण मूल्य पृष्ठभूमि गिनती और अनुक्रम या किनारा पूर्वाग्रहों का आकलन करने के लिए उपयुक्त नियंत्रण पर निर्भर है महत्वपूर्ण है । हम नियमित रूप से ७०% के करीब के KCl नमूनों में एक मानचित्रण दक्षता प्राप्त जब केवल अनुक्रम विशिष्ट endonuclease के साथ पचा (चित्र b, बाएं पैनलों) । इसके अलावा, यह पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि endonuclease उपचार HincII इलाज और अनुपचारित नमूनों (चित्र बी) की तुलना द्वारा शामिल ribonucleotides का समग्र पता लगाने को प्रभावित नहीं कर रहा है। इन प्रयोगों में, हम HincII उपयोग किया है साइट विशिष्ट कटौती परिचय, हालांकि अंय उच्च निष्ठा प्रतिबंध एंजाइमों भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
प्रोटोकॉल के लिए डीएनए घावों कि 5 ´-फॉस्फेट या 5 ´-ओह समाप्त होता है संसाधित किया जा सकता है के अंय प्रकार के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । परिणामों की सटीकता प्रसंस्करण की विशिष्टता पर निर्भर है और सत्यापन के लिए उपयुक्त नियंत्रण (जैसे, जंगली प्रकार या अनुपचारित) की आवश्यकता है । इसके अलावा, जब अन्य अनुप्रयोगों के लिए या अन्य जीवों के साथ उपयोग करने के लिए इस विधि के अनुकूल है, एक विचार करना चाहिए कि अपने वर्तमान सेटअप में विधि डीएनए के बारे में 1 µ जी जो एक पुस्तकालय के लिए संसाधित है की आवश्यकता है । सिरों की संख्या के बाद से एम्बेडेड ribonucleotides की संख्या पर निर्भर है, जो जीव या उत्परिवर्ती पर निर्भर करता है, ribonucleotides की एक कम संख्या सहित नमूने अधिक इनपुट डीएनए की आवश्यकता होती है में समाप्त होता है की एक पर्याप्त संख्या उत्पन्न करने के लिए बाद में पुस्तकालय निर्माण । इसी तरह, यदि डीएनए नमूनों ribonucleotides की एक बहुत अधिक संख्या है, यह भी कम इनपुट डीएनए का उपयोग करने के लिए बंधाव, दूसरा किनारा संश्लेषण के लिए इष्टतम स्थिति प्राप्त करने की आवश्यकता होगी, और पीसीआर प्रवर्धन । यह उल्लेखनीय है कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में पुस्तकालय निर्माण भी परमाणु जीनोम को कवर डेटा उत्पंन (जैसा कि चित्र 2dमें प्रदर्शित) और केवल डेटा विश्लेषण mtDNA पर ध्यान केंद्रित किया गया । यह दिखाता है कि मामूली कम ribonucleotide आवृत्तियों के साथ बड़े जीनोम भी इस विधि द्वारा कब्जा कर रहे हैं ।
जब इस विधि पर विचार, कुछ सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए: हालांकि इस विधि चाहिए, सिद्धांत रूप में, वस्तुतः किसी भी जीव के लिए लागू हो, एक उपयुक्त संदर्भ जीनोम पढ़ता के संरेखण के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल से प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधित्व कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या से पढ़ता है । कक्षों के सबसेट की विशिष्ट ribonucleotide निगमन प्रतिमान इस approach द्वारा पहचाना नहीं जा सकता । यदि ribonucleotides ribonucleotides की एक बहुत कम संख्या के साथ बड़े जीनोम में मैप कर रहे हैं, यह यादृच्छिक निक से भेदभाव ribonucleotides के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है और उचित नियंत्रण इसलिए की जरूरत है ।
विधि हम यहां का वर्णन है, जैसे HydEn-Seq16, Ribose-Seq17, पु-Seq18, या emRiboSeq19के रूप में vivo तकनीकों में उपलब्ध फैली हुई है । इन दृष्टिकोणों को क्षारीय या RNase H2 उपचार के लिए एंबेडेड ‘ ribonucleotides संवेदनशीलता का लाभ ले, क्रमशः, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण को रोजगार के लिए ribonucleotides जीनोम की पहचान चौड़ा है, जो उनके मानचित्रण और की तुलना की अनुमति देता है संबंधित शामिल है । डीएनए अनुक्रम सट द्वारा विशेष रूप से, के रूप में ऊपर वर्णित है, एंबेडेड ribonucleotides में alkaline hydrolysis के अलावा, ribonucleotides के लिए पढ़ता उन दरार साइटों को सामान्यीकृत किया जा सकता है, न केवल पहचान और मानचित्रण की अनुमति ribonucleotides, लेकिन यह भी एक डीएनए अणु के लिए उनके quantitation । डीएनए प्रतिकृति, डीएनए की मरंमत, और TLS से संबंधित रोगों के संदर्भ में हमारी तकनीक का आवेदन सामांय में अंतर्निहित आणविक तंत्र और जीनोम अखंडता में ribonucleotides की भूमिका की गहरी समझ प्रदान कर सकता है ।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के द्वारा समर्थित किया गया स्वीडिश अनुसंधान परिषद (www.vr.se) एआरसी को अनुदान (2014-6466 और स्वीडन फाउंडेशन के लिए सामरिक अनुसंधान (www.stratresearch.se) एआरसी (ICA14-0060). Chalmers यूनिवर्सिटी ऑफ टेक्नोलॉजी ने इस कार्य के दौरान MKME को वित्तीय सहायता प्रदान की. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी ।
Materials
| 10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0201S | |
| 10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0216L | |
| 1x PBS | Medicago | 09-9400-100 | dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 33539-1L-GL-R | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2940CA | |
| 50 mL Centrifuge Tube | VWR | 525-0610 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP, 10 mM) | New England Biolabs | P0756S | dilute with EB to 2 mM |
| Agilent DNA 1000 Kit | Agilent Technologies | 5067-1504 | |
| BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL) | New England Biolabs | B9000S | diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL |
| Buffer EB | QIAGEN | 19086 | referred to as EB |
| CleanPCR paramagnetic beads | CleanNA | CPCR-0050 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each) | New England Biolabs | N0447L | dilute with EB to 2 mM |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61965026 | |
| DynaMag 96 Side | Thermo Fisher | 12331D | |
| Ethanol 99.5% analytical grade | Solveco | 1395 | dilute with milliQ water to 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M) | Sigma-Aldrich | 03690-100ML | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10500056 | |
| HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC | AppliChem | A6906,0125 | |
| Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6) | Sigma-Aldrich | H7891-5G | dissolve in nuclease-free H2O for 10 M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment. |
| HincII | New England Biolabs | R0103S | supplied with NEBuffer 3.1 |
| Hybridiser HB-1D | Techne | FHB4DD | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | Kapa Biosystems | KK2602 | |
| Lysis buffer | 50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 µg/mL), 1% SDS | ||
| Micro tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Microcentrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000014 | |
| Microcentrifuge MiniStar silverline | VWR | 521-2844 | |
| Multiply µStripPro 0.2 mL tube | Sarstedt | 72.991.992 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| Phenol – chloroform – isoamyl alcohol (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 26764.232 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Potassium hydroxide (KOH) | VWR | 26668.296 | dissolve in nuclease-free H2O for 3 M solution, sterile filter |
| Proteinase K | Ambion | AM2546 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | CAUTION: Contains flammable and toxic components |
| Refrigerated Centrifuge 4K15 | Sigma Laboratory Centrifuges | No. 10740 | |
| SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553-035 | |
| Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc) | Sigma-Aldrich | S7899 | |
| Sodium chloride (NaCl) | VWR | 27810.295 | dissolve in nuclease-free H2O for 5 M solution, sterile filter |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (3' phosphatase minus) | New England Biolabs | M0236L | |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204L | supplied with PEG 8000 (50%) |
| T7 DNA Polymerase (unmodified) | New England Biolabs | M0274S | supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer |
| TE Buffer | Invitrogen | 12090015 | |
| ThermoMixer F2.0 | Eppendorf | 5387000013 |
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