Visualisatie van Thalamocortical Axon vertakking en de Synapse formatie in Organotypic Cocultures
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor gelijktijdige beeldvorming van thalamocortical axon vertakking en de synapse formatie in organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri. Individuele thalamocortical axonen en hun presynaptische terminals worden gevisualiseerd door een eencellige electroporation techniek met DsRed en synaptophysin van GFP-gelabeld.
Abstract
Axon vertakking en de synapse formatie zijn cruciale processen voor de vaststelling van nauwkeurige neuronale circuits. Tijdens de ontwikkeling vormen de sensorische thalamocortical (TC) axonen takken en synapsen in bepaalde lagen van de hersenschors. Ondanks de voor de hand liggende ruimtelijke correlatie tussen axon vertakking en de synapse formatie, is de causale relatie tussen hen slecht begrepen. Om aan te pakken dit probleem, ontwikkelde we onlangs een methode om gelijktijdige beeldvorming van vertakking en de synapse formatie van individuele TC axonen in organotypic cocultures.
Dit protocol beschrijft een methode die uit een combinatie van een organotypic coculture en electroporation bestaat. Organotypic cocultures van de thalamus en cortex cerebri vergemakkelijking van genetische manipulatie en waarneming van axonale processen, behoud van de karakteristieke structuren zoals laminaire configuratie. Twee verschillende plasmiden codering DsRed en EGFP-gelabeld synaptophysin (SYP-EGFP) waren samen transfected in een klein aantal thalamus neuronen door een electroporation techniek. Deze methode konden we visualiseren van individuele axonale morphologies van TC neuronen en hun presynaptische sites tegelijk. De methode ook ingeschakeld op lange termijn waarneming waaruit bleek het oorzakelijk verband tussen de axon vertakking en de synapse formatie.
Introduction
De projectie van de thalamocortical (TC) in de hersenen van zoogdieren is een geschikt systeem om axon begeleiding en gericht op mechanismen te onderzoeken. Tijdens de ontwikkeling groeien sensorische axonen van de TC in de corticale plaat, en de takken van de vorm en de synapsen bij voorkeur in laag IV van de primaire sensorische gebieden in de hersenschors1,2. Zelfs na de oprichting van fundamentele verbindingen, zijn axonale arbors en synaptische terminals verbouwd afhankelijk van milieuveranderingen3,4. Hoe de TC axon morfologie wordt dynamisch gewijzigd is echter slecht begrepen. Een van de belangrijkste redenen is het ontbreken van een adequate techniek te observeren van structurele veranderingen op het niveau van een enkele cel. Hoewel recente ontwikkelingen in microscopie, zoals twee-foton microscopie, hebben directe observatie van levende corticale neuronen in vivois toegestaan, zijn er nog steeds technische beperkingen voor het vastleggen van de algemene TC trajecten5, 6. Daarom, in vitro methoden voor live beeldvorming van TC axonen zou bieden krachtige hulpmiddelen voor structurele analyses van axon vertakking en de synapse formatie.
Onze fractie voor het eerst vastgesteld een statische segment cultuur methode met permeabel membraan7. Met deze methode een rat corticale segment was cocultured met een zintuiglijke thalamus blok en lamina-specifieke TC verbindingen werden gerecapituleerd in deze7,, organotypic cocultures8. Sparse labelen met een fluorescente proteïne verder konden we observeren TC axon groei en tak vorming9,10,11. Onlangs hebben we een nieuwe methode voor gelijktijdige beeldvorming van vertakking en synapse formatie van individuele TC axonen in de organotypic cocultures12. Om te visualiseren TC axonen en presynaptische sites tegelijk, waren DsRed en EGFP-gelabeld synaptophysin (SYP-EGFP) samen transfected in een klein aantal thalamus neuronen door electroporation van de organotypic coculture. De huidige methode morfologische analyse van TC axonen vergemakkelijkt en zorgt voor lange termijn waarneming, die kan worden gebruikt om het oorzakelijk verband tussen de axon vertakking en de synapse formatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol is ook een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de ontwikkelingsaspecten van groeiende axonen anders dan van de TC projectie11. Bijvoorbeeld, kunt een combinatie van corticale segment cultuur en de techniek electroporation visualiseren van individuele axonale morfologie van corticale neuronen en lange termijn waarneming9,18.
Met behulp van het huidige protocol, kunnen de rol van inter…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken ook Gabriel Hand voor de kritische lezing.
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
Referências
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
