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Bioengenharia

Desarrollo de un Biosensor de ADN electroquímico para la detección de un patógeno de transmisión alimentaria

Published: June 03, 2018
doi:
10.3791/56585
, , ,
1Laboratory of Food Safety and Food Integrity, Institute of Tropical Agriculture and Food Security,Universiti Putra Malaysia, 2Laboratory of Functional Device, Institute of Advanced Technology,Universiti Putra Malaysia, 3Department of Chemistry, Faculty of Science,Universiti Putra Malaysia, 4La Trobe Institute for Molecular Science,La Trobe University

Summary

Se presenta un protocolo para el desarrollo de un biosensor electroquímico de ADN que comprende un electrodo de carbono nanopartículas modificadas, serigrafiados oro, estabilizado con ácido del poliláctico para la detección de Vibrio parahaemolyticus .

Abstract

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) es un patógeno de los alimentos comunes que contribuye a una gran proporción de problemas de salud pública a nivel mundial, que afecten significativamente a la tasa de morbilidad y mortalidad humana. Los métodos convencionales para la detección de V. parahaemolyticus como métodos basados en la cultura, Ensayos inmunológicos y métodos moleculares requieren manejo muestras complicadas y lentas, tediosas y costosas. Recientemente, biosensores han demostrado para ser un método de detección completa y prometedores con las ventajas de la detección rápida, rentabilidad y practicidad. Esta investigación se centra en el desarrollo de un método rápido de detectar V. parahaemolyticus con alta selectividad y sensibilidad usando los principios de hibridación de ADN. En la obra, caracterización de poliláctico sintetizado estabilizado con ácido nanopartículas de oro (AuNPs de PLA) fue alcanzada usando difracción de rayos x (DRX), Espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis), microscopia electrónica de transmisión (TEM), emisión de campo Microscopía electrónica (FESEM) y voltametría cíclica (CV). También llevamos a cabo pruebas de estabilidad, sensibilidad y reproducibilidad de las AuNPs PLA. Encontramos que el PLA-AuNPs había formado una sólida estructura de nanopartículas estabilizadas en solución acuosa. También observamos que la sensibilidad mejoró como resultado el menor valor de resistencia (Rct) de transferencia de carga y un aumento del área superficial activa (0,41 cm2). El desarrollo de los biosensores de ADN se basó en la modificación de un electrodo serigrafiados de carbono (SPCE) con PLA-AuNPs y utilizando azul de metileno (MB) como el indicador de redox. Se evaluaron los acontecimientos de inmovilización e hibridación por voltametría de pulso diferencial (DPV). Encontramos complementarios, no complementarios, y oligonucleótidos no coincidentes específicamente fueron distinguidos por el biosensor fabricado. También se demostró la detección fiable sensible en estudios de reactividad cruzada contra diversos agentes patógenos transmitidos por los alimentos y en la identificación de V. parahaemolyticus en berberechos frescos.

Introduction

Un tema importante de debate público y científico en los últimos años, la intoxicación alimentaria se asocia fundamentalmente con 3 agentes: microorganismos1y química2parásitos3. Alimentos contaminados pueden causar consecuencias graves para la salud en seres humanos, especialmente en el grupo de mayor riesgo aquellos con sistemas inmunes débiles, los ancianos, mujeres embarazadas, bebés y niños pequeños4. Con más de 1 millón de casos de diarrea aguda que ocurre anualmente en niños menores de 5 años en África, Asia y América Latina, la intoxicación alimentaria es una importante enfermedad global5,6 y la Organización Mundial de la salud ha establecido microorganismos como el más importante colaborador7. Vibrio parahaemolyticus se destaca entre las más reconocidas cepas virulentas. Generalmente se encuentran en ambientes marinos, estuarinos y costeros8, es una bacteria gram negativa, que se activa en entornos de alta sal y causa grave gastroenteritis humana cuando está comido en marinos insuficientemente cocidos, maltratados o crudo productos9. Además, las condiciones médicas existentes en algunas personas hacen propensos a la infección de oído, septicemia o infección de V. parahaemolyticus10de la herida. Los factores de virulencia de V. parahaemolyticus hemolisinas se dividen en dos tipos que contribuyen a la patogénesis de la enfermedad: la hemolisina directa termoestable (TDH) codificadas por los genes tdh y hemolisina relacionada con TDH, codificadas por genes de trh11. Los marcadores de virulencia (genes tdh y trh) de V. parahaemolyticus se encuentran sobre todo en muestras clínicas y no en muestras ambientales.

V. parahaemolyticus posee la capacidad de sobrevivir en un amplio rango de condiciones, responder rápidamente a cambios ambientales12. Su mecanismo de proliferación aumenta su potencial de peligro como su toxicidad aumenta en paralelo con la masa de la celda13. Peor aún, el cambio climático está proporcionando estas bacterias con amplias condiciones para acelerar su célula de crecimiento población14. Debido a su alta frecuencia, V. parahaemolyticus necesita ser monitoreada a lo largo de la cadena alimentaria, particularmente en el comercio y la producción de pescados y mariscos ya que esos productos son donde se encuentran en cantidades enormes de15,16 en todo el mundo. Actualmente se identifican las bacterias y aislados utilizando una variedad de métodos, incluyendo pruebas bioquímicas, enriquecimiento y medios selectivos17, enzima-ligado Inmunomagnética sorbente ensayo (ELISA)18, electroforesis de pulso-campo (PFGE) 19, pruebas de aglutinación de látex y de polimerasa de las pruebas de reacción en cadena (PCR)20. Estos métodos generalmente requieren personal calificado, instrumentos sofisticados y técnicas laboriosas que no proporcionan información sobre la contaminación inmediatamente. Esto limita seriamente la posibilidad de detectar con prontitud contaminación perjudicial y aplicaciones in situ. Herramientas de detección rápida siguen siendo un desafío excepcional.

Biodetección está emergiendo como una opción promisoria para la detección de patógenos alimentarios ya que ofrece un ahorro de tiempo, rentable, práctico y en tiempo real análisis método21,22,23,24 . Sin embargo, aunque ha habido muchos resultados positivos de la detección de analitos en las muestras inoculadas y solución mediante biosensores, todavía hay una falta de investigación aplicada a muestras reales en mezclas acuosas o extractos orgánicos25. Recientemente, biosensores electroquímicos utilizando detección directa y/o indirecta del ácido desoxirribonucléico (ADN) han recibido una atención creciente entre los científicos, debido a su detección específica del objetivo complementario a través de un evento de hibridación26 , 27 , 28 , 29. estos enfoques únicos son más estables en comparación con los biosensores basados en enzimas, ofreciendo así una tecnología prometedora para la miniaturización y comercialización. El objetivo del estudio aquí reportado es construir una herramienta rápida que puede detectar V. parahaemolyticus con alta selectividad, sensibilidad y sentido práctico, basado en la especificidad de secuencia de ADN durante la hibridación. Estrategias de identificación implican la combinación de nanopartículas de oro (AuNPs de PLA) estabilizado con ácido poliláctico30 y electrodos serigrafiados de carbono (SPCEs) en presencia del indicador de hibridación, azul de metileno (MB). El potencial de la construcción de detección desarrollados es explorado utilizando muestras de berberechos frescos y lisado de ADN de las bacterias.

Protocol

Nota: Todos los reactivos químicos y bioquímicos para ser utilizado deben ser de grado analítico y utilizan sin purificación adicional. Preparar todas las soluciones utilizando agua desionizada estéril. Autoclave de toda la cristalería antes de la esterilización. PRECAUCIÓN: Utilice todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando se realizan actividades de laboratorio, incluyendo el uso de controles (campana, guantera) de ingeniería y equipo de protección personal (gafas, guantes…

Representative Results

Formación de AuNPs fue revelada a través del cambio en el color de la solución acuosa con citrato de sodio presente. Esto causó que el color cambie de amarillo claro a un rojo rubí profundo. La generación de AuNPs PLA fue confirmada de los espectros UV-vis (figura 1) donde el crecimiento del pico de resonancia (SPR) de plasmón superficial se encontró a alrededor de 540 nm. La formación y existencia de AuNPs PLA fue indicada en las gamas de longitud d…

Discussion

Los pasos críticos en un marco para el desarrollo exitoso de este tipo de biosensor electroquímico son selección de elementos de reconocimiento biológico apropiado para el transductor (ácido nucleico o ADN aquí); enfoque de química para la construcción de la capa de detección del transductor; material de transducción de señales; optimización de inmovilización del DNA e hibridación; y validación del biosensor desarrollado con muestras reales.

Base para el desarrollo de un biosens…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean reconocer el apoyo de Universiti Putra Malasia.

Materials

Acetic acid Merck 100056
Chloroform Merck 102445
Diaminoethane tetraacetic acid Promega E5134
Dibasic sodium phosphate  Sigma-Aldrich S9763
Disodium hydrogen phosphate Sigma-Aldrich 255793
Ethanol  Sigma-Aldrich 16368
Gold (III) chloride trihydrate Sigma-Aldrich 520918
Hydrochloric acid Merck 100317
Methylene blue Sigma-Aldrich M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate Sigma-Aldrich S3522
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D NatureWorks 4042D
Potassium chloride R&M Chemicals 59435
Potassium dihydrogen phosphate Sigma-Aldrich P9791
Potassium hexacyanoferrate III R&M Chemicals 208019
Sodium acetate anhydrous salt Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888
Trisodium citrate Sigma-Aldrich S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane Fisher Scientific T395-100
Tris-Base Fisher Scientific BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye Norgen Biotek 28240
Agarose gel Merck 101236
Bolton Agar Merck 100079
Bolton Broth Merck 100079
CHROMagar Vibrio CHROMagar VB910
dNTPs Promega U1511
Nuclease-free water Thermo Scientific R0581
Eosin methylene blue agar  Merck 101347
GelRed Biotium 41001
Glycerol Merck 104092
Go Taq Buffer Promega M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder Promega G2101
Loading dye 1kb DNA ladder Promega G5711
Magnesium chloride Promega 91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar Merck 105267
McConkey Agar Merck 105465
Nutrient Broth Merck 105443
Taq polymerase Merck 71003
Trypticase Soy Broth Merck 105459
Trypticase Soy Agar Merck 105458
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Keywords: Electrochemical DNA BiosensorFoodborne Pathogen DetectionGold NanoparticlesPolylactic AcidScreen Printed Carbon ElectrodeMethylene BlueDifferential Pulse VoltammetryHybridizationUV-vis SpectroscopyXRDTEMFESEM-EDXElectrochemical Characterization
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Nordin, N., Yusof, N. A., Radu, S., Hushiarian, R. Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen. J. Vis. Exp. (136), e56585, doi:10.3791/56585 (2018).
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