וזמינותו כתב המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית פשוט לזהות את מרכיבי התא הדרושות רעלן ריצין שרשרת (RTA) סחר בבני אדם שמרים
Summary
בכתב היד, נתאר את השימוש assay כתב המבוסס על שמרים זריחה כדי לזהות רכיבים התאית מעורבת הסחר ולהרוג את התהליכים של ציטוטוקסיות של יחידת משנה של ריצין הרעלן הצמח (RTA).
Abstract
בקטריאלי, צמח A / B רעלים ניצול של מסלולים סחר טבעי בתאים האיקריוטים להגיע שלהם target(s) תאיים ב ציטוזול ו להרוג בסופו של דבר. כזה A / B רעלים מורכבת בדרך כלל פעיל enzymatically Asubunit (למשל, ריצין רעלן (RTA)), תא אחד או יותר מחייב Bsubunit(s), אשר אחראים על רעלן קשירה ספציפי ל התא קולטנים משטח. הידע הנוכחי שלנו על איך A / B רעלים מסוגלים ביעילות משכר תאי עזר מדענים להבין את המנגנונים התאיים הבסיסיים, כמו אנדוציטוזה וחלבון תאיים מיון גבוהה התאים האיקריוטים. מנקודת מבט רפואית, חשוב גם לזהות את המסלולים סחר הרעלן הגדולות כדי למצוא פתרונות טיפול הולם עבור חולים או ובסופו של דבר לפתח יישומים מבוססי-הרעלן טיפולית לטיפול בסרטן.
מאז ניתוח ברמת הגנום של A / הרעלן B תאים בתרבית של סחר בבני אדם היא מורכבת, גוזלת זמן יקר, מספר מחקרים על A / B הרעלן תחבורה בוצעו באורגניזם מודל שמרים האפייה. למרות היותו פחות מורכב, יסוד תהליכים תאיים שמרים ואת התאים האיקריוטים גבוה יותר דומים הינם לעיתים קרובות התוצאות המתקבלות שמרים ניתן להעביר למצב יונקים.
כאן, אנו מתארים assay כתב מהיר, קל לשימוש כדי לנתח את וגדילת של RTA ב שמרים. היתרון חיוני וזמינותו חדשה הוא הזדמנות לחקור לא רק RTA רטרו-טרנסלוקציה של תוך-פלזמית (ER) ציטוזול, אבל מעדיף אנדוציטוזה, הרעלן רטרוגרדית תחבורה של קרום פלזמה לחדר המיון. הבדיקה עושה שימוש פלסמיד כתב המאפשר מדידה עקיפות של RTA רעילות דרך פליטת קרינה פלואורסצנטית חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לאחר תרגום ויוו . מאז RTA מונע ביעילות אתחול של חלבון ביוסינטזה מאת 28S rRNA depurination, וזמינותו זו מאפשרת זיהוי חלבונים בתא המארח מעורב התחבורה RTA תאיים באמצעות זיהוי שינויים פליטת קרינה פלואורסצנטית.
Introduction
חולים הסובלים זיהומים על ידי הרעלן לייצר חיידקים מייצגים מעמסה רפואית וכלכלית חמורה עבור כל מערכת הבריאות חברתית, במיוחד מאז טיפולי יעיל חסרים עדיין במידה רבה. לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, מנגנונים מורכבים שיכרון א גם לא רלוונטי רפואית / B רעלנים כגון כולרה טוקסין, רעלן שיגה או ריצין צריך להיות מובן במלואו ברמה המולקולרית המבוססת על הרומן מבחני רב עוצמה שיש ליישם.
בשנים האחרונות, מספר מחקרים ניסו לנתח A / B הרעלן תחבורה בין שמרים בתרבית של תאים באמצעות שיטות ועתירת עלות עתירי כמו רעלן רדיואקטיבי תיוג1,2 , כמו גם סינון שמבוסס siRNA ניגש3. במקרים מסוימים, הרעלן סחר כבר מטמיעים ויוו על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ לאחר צימוד כימי ו/או גנטי של הרעלן בודדים subunits עם fluorophores, נקודות קוונטיות או חלבונים פלורסנט4,5. למרבה הצער, ושינויים אלו לעיתים קרובות להוביל מאפיינים טבעיים לא פעילים ו/או שינו הרעלנים. דרך אלגנטית נוספת בעקיפין לענות על מגוון רחב של שאלות מדעיות היא השימוש במערכות כתב המבוסס על אנזימים כגון לוציפראז lacZ, או חלבונים פלורסנט (למשל GFP או Discosoma sp. (חלבון פלואורסצנטי אדום dsRed)).
כתב יד זה, מתואר פרוטוקול פשוט אשר מזהה הסלולר הרכיבים הדרושים עבור הובלה תאיים של RTA extracellularly יישומית ב cerevisiae ס. ובכך, זריחה-כתב פלסמיד המכיל אות N-מסוף ER-ייבוא ואחריו GFP משמש חיישן ביוסינטזה חלבון, אשר מודד בעקיפין בתיווך RTA חלבון תרגום עיכוב על ידי GFP פלורסצנטיות פליטה לאחר ויוו תרגום6. במקרה זה RTA אנדוציטוזה ו/או וגדילת לרעה (או באופן חיובי) מושפע ב מוטציה מחיקה שמרים מסוים לעומת פראי-סוג, זה ניתן לאתר באמצעות עלייה (או ירידה) פליטת קרינה פלואורסצנטית GFP6.
עד כה, כל שיטות ניתוח תחבורה RTA תאי שמרים היו מוגבלים לתהליך רטרו-רוברטסונית אר-אל-ציטוזול RTA. במערכת כזו מלאכותי, מתבטאת RTA המכיל אות ייבוא אר מ יזם inducible וכתוצאה מכך פנוטיפ אובדניות1,7. למרות התא מחייב B-יחידת משנה של ריצין הוא חסר הגדרת הניסוי המתואר בכתב היד, וכך, לא לגמרי מייצגים את המצב הטבעי של שיכרון ריצין holotoxin8, הרעלן תחבורה של פלזמה ממברנה דרך מנגנון גולג’י לחדר המיון יכול להיות חיקה בשיתוף פעולה הדוק עם assay הרומן הזה. מעניין, תוצאות ראשוניות שהושגו במחקר פיילוט מציינים כי המסלולים סחר בשימוש על ידי RTA לחשוף את הדמיון הבולט עם תוואי שיכרון ריצין holotoxin.
לסיכום, שיטת שתואר יכול לשמש כדי לקבוע את התפקיד הספציפי של החלבונים שנבחרו ב- RTA אנדוציטוזה, סחר בבני אדם שמרים. יתר על כן, הגדרת הניסוי הזה יכול בקלות להתאים אחרים ריבוזום inactivating רעלנים המופרשים שמרים שונים ומינים חיידקיים כגון zymocin או טוקסין שיגה והופק.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעת ביצוע בפרוטוקול לעיל, אנו ממליצים על ההצעות הבאות על מנת להשיג תוצאות מוצלחות של הניסוי.
ביטוי חלבון heterologous, חשוב לא תעלה על ריכוז IPTG של 1 מ מ. ריכוז IPTG > 1 מ”מ לעכב יזם-induced RTA ביטוי ולהוביל להורדת התשואות הרעלן. יתר על כן, התאים לא צריך להיות מעובד בטמפרטורה גבוהה יותר 28 ° C …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
חלקים של מחקר זה היו מתבקשים נתמך על ידי מענק של פתוח (SFB 1027, A6).
Materials
| Bacterial and yeast strains | |||
| E coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
Referências
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
