مقايسة مراسل المستندة إلى الأسفار بسيطة لتحديد المكونات الخلوية اللازمة للريسين سلسلة (RTA) الاتجار بالخميرة
Summary
في هذه المخطوطة، يصف لنا استخدام مقايسة مراسل fluorescence المستندة إلى الخميرة تحديد المكونات الخلوية متورطة في تهريب وقتل العمليات للسآمة للخلايا وحدة فرعية من مادة الريسين السمية النباتية (RTA).
Abstract
البكتيريا والنبات A/السموم ب استغلال مسارات الاتجار بالأشخاص الطبيعية في الخلايا حقيقية النواة للوصول إلى بهم داخل الخلية الهدف (ق) في سيتوسول وقتل في نهاية المطاف. هذه A/السموم ب تتألف عموما من نشاط انزيماتيكالي أسوبونيت (مثلاً، الريسين (RTA)) وخلية واحدة أو أكثر ملزم Bsubunit(s)، التي تعتبر مسؤولة عن السمية ملزمة محددة إلى الخلية المستقبلات السطحية. معرفتنا الحالية بطريقة أ/ب السموم قادرون على المسكرة العلماء الخلايا التي ساعدت على فهم الآليات الخلوية الأساسية، مثل الالتقام والبروتين داخل الخلية الفرز في الخلايا حقيقية النواة أعلى كفاءة. من وجهة نظر طبية، من المهم أيضا تحديد طرق الاتجار السمية الرئيسية لإيجاد حلول العلاج المناسب للمرضى أو لتطوير التطبيقات العلاجية على أساس السمية لعلاج السرطان في نهاية المطاف.
منذ التحليلات على نطاق الجينوم (أ) والتكسينية ب الاتجار في خلايا الثدييات هي معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة، عدة دراسات على أ/ب السم النقل قد أجريت في الحي النموذجي الخميرة Saccharomyces cerevisiae. على الرغم من كونها أقل تعقيداً العمليات الخلوية الأساسية في الخميرة وخلايا حقيقية النواة أعلى كثيرا من النتائج التي تحققت في الخميرة وهي مماثلة يمكن نقلها إلى حالة الثدييات.
هنا، يمكننا وصف مقايسة مراسل سريعة وسهلة الاستخدام لتحليل الاتجار داخل الخلايا لهيئة الطرق والمواصلات في الخميرة. ميزة أساسية للتحليل الجديد الفرصة للتحقيق ليس فقط المواصلات الرجعية-إزفاء من هيولى (ER) إلى سيتوسول، ولكن بدلاً من ذلك النقل الالتقام والسمية إلى الوراء من غشاء البلازما لائحة. الإنزيم يجعل استخدام بلازميد المراسل تمكن من قياس غير مباشر سمية هيئة الطرق والمواصلات من خلال الانبعاثات الأسفار من البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) وبعد الترجمة في فيفو . هذا الإنزيم منذ المواصلات كفاءة يمنع الشروع في تخليق البروتين الحيوي قبل 28S الرنا الريباسي ديبورينيشن، يسمح تحديد بروتينات الخلية المضيفة المعنية بالنقل المواصلات داخل الخلايا عن طريق الكشف عن التغييرات في الانبعاثات الأسفار.
Introduction
المرضى الذين يعانون من التهابات بالسمية تنتج البكتيريا تمثل عبئا طبية ومالية شديدة لكل نظام الرعاية الصحية الاجتماعية، لا سيما نظراً لكفاءة العلاجات العلاجية لا تزال مفقودة إلى حد كبير. لوضع استراتيجيات علاجية جديدة، آليات التسمم معقدة من الناحية الطبية ذات الصلة/ب السموم مثل الكوليرا السمية، والسمية شيغا، أو الريسين يجب أن تكون مفهومة تماما على المستوى الجزيئي استناداً إلى رواية فحوصات القوية التي يتعين تنفيذها.
في السنوات الأخيرة، حاولت عدة دراسات لتحليل أ/ب السم النقل في خلايا الثدييات باستخدام أساليب مضيعة للوقت وباهظة التكلفة مثل السمية الإشعاعية والخميرة وسم1،2 ، فضلا عن الفحص على أساس siRNA تقترب من3. وفي بعض الحالات، الاتجار بالسمية قد تصور في فيفو بالفحص المجهري الأسفار بعد اقتران الكيميائية و/أو الوراثية لمفارز السمية الفردية مع فلوروفوريس أو النقاط الكم أو بروتينات الفلورسنت4،5. لسوء الحظ، مثل هذه التعديلات غالباً ما تؤدي إلى غير نشط و/أو تغيير الخصائص الطبيعية للسموم. طريقة أنيقة أخرى غير مباشر الإجابة على مجموعة واسعة من المسائل العلمية هو استخدام نظم مراسل استناداً إلى الإنزيمات مثل لاكز، لوسيفراس، أو البروتينات الفلورية (مثل التجارة والنقل أو ديسكوسوما sp. (البروتين الأحمر نيون دسريد)).
في هذه المخطوطة، يوصف بروتوكول بسيط الذي يحدد مكونات الخلوية اللازمة للنقل داخل الخلايا للمواصلات اكستراسيلولارلي التطبيقية في S. cerevisiae. وبالتالي، بلازميد مراسل الأسفار التي تحتوي على إشارة الطرفي ن ER-استيراد تليها التجارة والنقل بمثابة جهاز استشعار بروتين الحيوي، الذي يقيس تثبيط البروتين هيئة الطرق والمواصلات بوساطة الترجمة غير مباشر بالتجارة والنقل fluorescence الانبعاثات بعد الحية الترجمة6. في حالة أن الالتقام المواصلات و/أو الاتجار بها داخل الخلايا سلبا (أو إيجاباً) يتأثر في متحولة حذف خميرة خاصة مقارنة بالبرية من نوع، يمكن هذا الكشف من خلال الزيادة (أو النقصان) في التجارة والنقل fluorescence انبعاث6.
وحتى الآن، جميع أساليب تحليل النقل المواصلات في خلايا الخميرة اقتصرت على عملية الرجعية-إزفاء ER إلى سيتوسول لهيئة الطرق والمواصلات. في مثل هذا نظام مصطنع، يعبر عن المواصلات التي تحتوي على إشارة استيراد ER من عاملاً إيندوسيبلي أدى إلى الانتحار من النمط الظاهري1،7. على الرغم من أن الخلية ملزمة ب-وحدة فرعية من مادة الرايسين المثل مفقود في الإعداد التجريبي المبين في هذه المخطوطة، وهكذا، لا يعكس الحالة الطبيعية لمادة الرايسين هولوتوكسين التسمم8، النقل السمية من البلازما يمكن أن يكون الغشاء عن طريق جهاز غولجي للائحة يحاكي عن كثب مع هذا التحليل رواية. من المثير للاهتمام، تشير النتائج الأولية التي تم الحصول عليها في الدراسة التجريبية إلى أن مسارات الاتجار استخدامها من قبل هيئة الطرق والمواصلات تكشف عن أوجه الشبه ملفتة للنظر مع مسار التسمم بالريسين هولوتوكسين.
وباختصار، يمكن استخدام الأسلوب وصف لتحديد الدور المحدد للاتجار بالخميرة والبروتينات الخلوية المحدد في الالتقام هيئة الطرق والمواصلات. وعلاوة على ذلك، هذا الإعداد التجريبية قد تكون تتكيف بسهولة مع الريبوسوم الأخرى يخمد السموم المنتجة ويفرز من مختلف الأنواع البكتيرية مثل زيموسين أو السمية شيغا والخميرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند تنفيذ هذا البروتوكول، نوصي بالاقتراحات التالية لتحقيق نتيجة ناجحة لهذه التجربة.
للتعبير مغايرة من البروتين، ومن المهم أن لا يتجاوز تركيز إيبتج 1 مم. تركيزات إيبتج > 1 مم تمنع التعبير هيئة الطرق والمواصلات وتؤدي إلى انخفاض غلة السمية المستحثة بالمروج. وعلاوة على ذلك، ا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكانت أجزاء من هذه الدراسة يرجى تدعمها منحة من دويتشه الأوقيانوغرافية (SFB 1027، A6).
Materials
| Bacterial and yeast strains | |||
| E coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
Referências
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
