Een eenvoudige fluorescentie gebaseerde verslaggever Assay identificatie van cellulaire bestanddelen die nodig zijn voor ricine toxine een keten (RTA) handel in gist
Summary
In het manuscript beschrijven we het gebruik van een kwantitatieve analyse van gist gebaseerde fluorescentie, verslaggever te identificeren van cellulaire componenten betrokken bij de handel en het doden van processen van de cytotoxische een subeenheid van de plant toxine ricine (RTA).
Abstract
Bacteriële en plant A / B toxines exploit de natuurlijke mensenhandel trajecten in eukaryotische cellen te bereiken hun intracellulaire doelgroep in het cytosol en uiteindelijk doden. Dergelijke A / B-toxine in het algemeen bestaan uit een enzymatisch actieve Asubunit (b.v., ricine toxine een (RTA)) en een of meer cellen bindende Bsubunit(s), die verantwoordelijk zijn voor de toxine binden aan specifieke cel oppervlakte receptoren. Onze huidige kennis van hoe A / B toxines in staat efficiënt bedwelmende cellen geholpen wetenschappers om te begrijpen fundamentele cellulaire mechanismen, zoals endocytose en intracellulaire eiwitten sorteren in hogere eukaryotische cellen zijn. Vanuit een medisch oogpunt is het ook belangrijk om te identificeren van de aanvoerroutes van grote toxine adequate behandeling om oplossingen te vinden voor patiënten of uiteindelijk therapeutische toxine gebaseerde om toepassingen te ontwikkelen voor kankertherapie.
Sinds het genoom-brede analyse van A / B-toxine handel in zoogdiercellen is complex, tijdrovend en duur, verschillende studies over A / B-toxine vervoer zijn uitgevoerd in de modelorganisme gist Saccharomyces cerevisiae. Ondanks het feit dat minder complex, fundamenteel cellulaire processen in gist en hogere eukaryotische cellen kunnen zijn vergelijkbaar en heel vaak de resultaten die zijn verkregen in gist worden overgedragen aan de zoogdieren situatie.
Hier beschrijven we een snelle en makkelijk te gebruiken verslaggever assay voor het analyseren van de intracellulaire mensenhandel van RTA gist. Een essentieel voordeel van de nieuwe bepaling is de mogelijkheid te onderzoeken van niet alleen RTA retro-translocatie van het endoplasmatisch reticulum (ER) in het cytosol, maar eerder endocytose en retrograde toxine transport uit het plasma-membraan in de ER. De bepaling maakt gebruik van een verslaggever plasmide waarmee indirecte meting van RTA toxiciteit door fluorescentie emissie van de groen fluorescente proteïne (GFP) na in vivo vertaling. Sinds de opening van de proteïne biosynthese RTA efficiënt door 28 rRNA depurination voorkomt, kan deze test de identificatie van de ontvangende cel eiwitten die betrokken zijn bij intracellulair RTA transport via de detectie van veranderingen in fluorescentie emissie.
Introduction
Patiënten met infecties door toxine producerende bacteriën vertegenwoordigen een ernstige medische en financiële lasten voor elke sociale systeem van de gezondheidszorg, in het bijzonder aangezien efficiënte therapeutische behandelingen nog grotendeels ontbreekt zijn. Ontwikkelen van nieuwe therapeutische strategieën, de mechanismen van de complexe intoxicatie van medisch relevante A / B toxines zoals cholera-toxine, Shiga-toxine of ricine moeten volledig worden begrepen op moleculair niveau gebaseerd op de roman krachtige tests die moeten worden uitgevoerd.
In de afgelopen jaren geprobeerd verschillende studies voor het analyseren van A / B-toxine vervoer in gist en zoogdiercellen met behulp van tijdrovende en kostenintensieve methoden zoals radioactieve toxine labeling1,2 , alsmede siRNA gebaseerde screening 3benaderingen. In sommige gevallen toxine mensenhandel gevisualiseerde geweest in vivo door fluorescentie microscopie na chemische en/of genetische koppeling van individuele toxine subeenheden met fluorophores, quantumdots of fluorescerende eiwitten4,5. Helaas leiden dergelijke wijzigingen vaak tot inactieve en/of gewijzigde natuurlijke eigenschappen van de toxines. Een andere elegante manier om niet indirect een breed scala aan wetenschappelijke vragen te beantwoorden is het gebruik van verslaggever systemen op basis van enzymen zoals lacZ, luciferase of fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeld GFP of Discosoma sp. rood fluorescerende eiwit () dsRed)).
In dit manuscript, is een eenvoudig protocol beschreven waarin het cellulaire componenten die nodig zijn voor het intracellulair transport van extracellularly toegepaste RTA in S. cerevisiae. Daarmee fungeert een fluorescentie-reporter plasmide met een N-terminal ER-import signaal gevolgd door GFP als een eiwit biosynthese sensor, die niet indirect RTA-gemedieerde eiwit vertaling remming door GFP fluorescentie emissie na in vivo meet vertaling6. In geval dat RTA endocytose en/of intracellulaire handel negatief (of positief) ondergaat in een bepaalde gist schrapping mutant in vergelijking met wild-type, kan dit worden gedetecteerd via een toename (of afname) in GFP fluorescentie emissie6.
Tot nu toe waren alle methoden analyseren van RTA vervoer in gistcellen beperkt tot de ER-te-cytosol retro-translocatie proces van RTA. In zulk een kunstmatige systeem, RTA met een signaal van de import ER zich van een afleidbare promotor, resulterend in een suïcidale fenotype1,7. Hoewel de cel B-subunit van ricine bindend eveneens in de experimentele opstelling wordt beschreven in dit manuscript ontbreekt en, zo niet geheel representatief is de natuurlijke situatie van ricine holotoxin intoxicatie8, vervoer van toxine van het plasma membraan door het Golgi-apparaat naar de ER kan nauw met deze nieuwe test worden geïmiteerd. Interessant is dat blijkt de voorlopige resultaten van de pilot-studie dat de mensenhandel trajecten gebruikt door RTA opvallende gelijkenissen met de route van de dronkenschap van ricine holotoxin onthullen.
Kortom, kan de beschreven methode worden gebruikt om te bepalen van de specifieke rol van geselecteerde cellulaire eiwitten in RTA endocytose en handel in gist. Bovendien, deze experimentele opstelling kan gemakkelijk worden aangepast aan andere ribosoom inactiveren toxines geproduceerd en uitgescheiden door verschillende gist en bacteriesoorten zoals zymocin of Shiga-toxine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bij het uitvoeren van het bovengenoemde protocol, raden we de volgende suggesties om een geslaagde uitkomst van het experiment.
Voor heterologe eiwit expressie is het belangrijk niet meer bedragen dan de concentratie van de IPTG van 1 mM. IPTG concentraties > 1 mM remmen promotor-geïnduceerde RTA expressie en leiden tot lagere opbrengsten van de toxine. Bovendien moeten cellen niet gekweekt worden bij temperaturen hoger dan 28 ° C om te voorkomen dat integratie lichaam vorming, ineffici?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Delen van deze studie waren vriendelijk, gesteund door een subsidie van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Bacterial and yeast strains | |||
| E coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
Referências
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
