Un dosage Simple journaliste Fluorescence pour identifier les composants cellulaires nécessaires à la ricine toxine une chaîne (RTA) traite des levures
Summary
Dans le manuscrit, nous décrivons l’utilisation d’un essai de journaliste de fluorescence à base de levure pour identifier les composants cellulaires impliqués dans le trafic et de tuer les processus de la cytotoxique une sous-unité de la ricine de toxine végétale (RTA).
Abstract
Bactérienne et centrale A / toxines B exploitent les voies naturelles de trafic dans les cellules eucaryotes pour atteindre leurs cibles intracellulaires dans le cytosol et finalement tuer. Tel A / toxines B sont généralement consistant d’un enzymatiquement actif Asubunit (p. ex., la toxine A (RTA) de la ricine) et une ou plusieurs cellule lie Bsubunit(s), qui est responsables de toxine contraignantes spécifiques des récepteurs de surface de cellules. Nos connaissances actuelles de la façon dont A / B toxines sont capables d’enivrantes efficacement aidés les cellules scientifiques pour comprendre les mécanismes cellulaires fondamentaux, comme l’endocytose et intracellulaire des protéines dans les cellules eucaryotes supérieures de tri. D’un point de vue médical, il est également important d’identifier les voies du trafic toxine majeure à trouver des solutions de traitement approprié pour les patients ou à finissent par développer des applications thérapeutiques pour le traitement du cancer à base de toxines.
Depuis les analyses du génome de A / la toxine B traite des cellules de mammifères est complexe, fastidieux et coûteux, plusieurs études sur A / transport de toxine B ont été réalisées dans l’organisme modèle de levure Saccharomyces cerevisiae. Bien qu’il soit moins complexes, fondamentaux des processus cellulaires chez les levures et les cellules eucaryotes supérieures sont semblables et très souvent les résultats obtenus chez les levures peuvent être transférées à la situation chez les mammifères.
Nous décrivons ici un essai de journaliste rapide et facile à utiliser pour analyser le trafic intracellulaire de RTA dans la levure. Un avantage essentiel de la nouvelle méthode de dosage est l’occasion d’étudier non seulement la RTA rétro-translocation du réticulum endoplasmique (ER) dans le cytosol, mais plutôt l’endocytose et toxine rétrograde de transport de la membrane plasmique dans le re. Le test utilise un plasmide de journaliste qui permet une mesure indirecte de la toxicité de la RTA à travers l’émission de fluorescence de la protéine fluorescente verte (GFP) après in vivo de la traduction. Comme RTA empêche efficacement l’initiation de la biosynthèse des protéines par dépurination ARNr 28 s, ce test permet l’identification des protéines de cellules hôtes impliqués dans le transport intracellulaire de RTA par le biais de la détection de changements dans l’émission de fluorescence.
Introduction
Patients souffrant d’infections par des bactéries productrices de toxine représentent un fardeau médical et financier grave pour chaque système de soins de santé social, en particulier les traitements thérapeutiques efficaces étant encore largement défaut. À élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques, les mécanismes de l’intoxication complexe de médicalement pertinente A / toxines B tels que la toxine cholérique, Shiga toxine ou ricine doivent être entièrement comprises au niveau moléculaire issu des nouveaux dosages puissants qui doivent être mises en œuvre.
Ces dernières années, plusieurs études ont tenté d’analyser A / transport de toxine B chez les levures et les cellules de mammifères en utilisant des méthodes fastidieuses et coûteuses telles que les toxines radioactives étiquetage1,2 mais aussi de dépistage basé sur siRNA 3les approches. Dans certains cas, traite de la toxine a été visualisée in vivo par microscopie de fluorescence après couplage chimique ou génétique des sous-unités de la toxine individuelle avec des fluorophores, points quantiques ou protéines fluorescentes4,5. Malheureusement, ces modifications entraînent souvent inactives et/ou altération des propriétés naturelles des toxines. Une autre façon élégante de répondre indirectement à une grande variété de questions scientifiques est l’utilisation de systèmes de journaliste issu des enzymes comme lacZ, luciférase, ou protéines fluorescentes (p. ex. GFP ou Acropora sp. (protéine fluorescente rouge dsRed)).
Dans ce manuscrit, un protocole simple est décrite qui identifie les composants cellulaires requis pour le transport intracellulaire des RTA extracellulaire appliquée chez S. cerevisiae. Ainsi, un plasmide de fluorescence-journaliste contenant un signal de N-borne ER-import suivi de GFP agit comme un capteur de biosynthèse de protéine, qui mesure indirectement l’inhibition de la protéine induite par la RTA traduction par GFP émission de fluorescence après in vivo traduction6. En cas que l’endocytose RTA et/ou trafic intracellulaire est négativement (ou positivement) affectés dans un mutant de délétion de levure particulière par rapport au type sauvage, cela peut être détectée par une augmentation (ou diminution) dans GFP fluorescence d’émission6.
Jusqu’ici, toutes les méthodes d’analyse transport RTA dans les cellules de levure sont limitaient au processus de rétro-translocation ER-à-cytosol de RTA. Dans un tel système artificiel, RTA contenant un signal d’importation ER s’exprime d’un promoteur inductible, ce qui entraîne un phénotype suicidaire1,7. Bien que la cellule liant la sous-unité B de la ricine est également absent dans le dispositif expérimental décrit dans ce manuscrit et, ainsi, ne pas entièrement représente la situation naturelle de ricine holotoxine intoxication8, transport de la toxine du plasma membrane à travers l’appareil de Golgi à la salle d’urgence peut être imité étroitement avec ce nouveau dosage. Fait intéressant, les résultats préliminaires obtenus dans l’étude pilote indiquent que les voies de trafic utilisés par RTA révèlent des ressemblances frappantes avec la route de l’intoxication de ricine holotoxine.
En résumé, la méthode décrite peut être utilisée pour déterminer le rôle spécifique des protéines cellulaires sélectionnés dans l’endocytose de la RTA et traite des levures. En outre, ce dispositif expérimental pourrait être facilement adapté aux autres ribosomes inactivation des toxines produites et sécrétées par les différentes levures et espèces bactériennes telles que zymocin ou la toxine de Shiga.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lorsque vous effectuez le protocole ci-dessus, nous vous recommandons les suggestions suivantes pour parvenir à une issue positive de l’expérience.
Pour l’expression de la protéine hétérologue, il est important pour ne pas dépasser la concentration de l’IPTG de 1 mM. Concentrations de l’IPTG > 1 mM inhibent l’expression de RTA induite par le promoteur et le plomb pour abaisser les rendements de la toxine. En outre, les cellules ne soient pas cultivées à des températures …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Parties de cette étude ont été gracieusement pris en charge par une bourse de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Bacterial and yeast strains | |||
| E coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
Referências
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