एक साधारण प्रतिदीप्ति-रिपोर्टर परख सेलुलर घटकों की पहचान करने के लिए Ricin विष के लिए आवश्यक एक श्रृंखला (आरटीए) खमीर में तस्करी
Summary
पांडुलिपि में, हम एक खमीर के उपयोग का वर्णन आधारित प्रतिदीप्ति रिपोर्टर परख के लिए सेलुलर और साइटोटोक्सिक संयंत्र विष ricin (आरटीए) के एक उपइकाई की हत्या की प्रक्रिया में शामिल घटकों की पहचान ।
Abstract
बैक्टीरियल और संयंत्र एक/बी विषाक्त पदार्थों युकेरियोटिक कोशिकाओं में प्राकृतिक तस्करी रास्ते का दोहन करने के लिए cytosol में अपने intracellular लक्ष्य (ओं) तक पहुंचने और अंततः को मारने के लिए । इस तरह के एक/बी विषाक्त पदार्थों को आम तौर पर एक enzymatically सक्रिय Asubunit से मिलकर बनताहै (जैसे, ricin विष एक (आरटीए)) और एक या एक से अधिक सेल बाध्यकारी Bsubunit (ओं) है, जो विशिष्ट कोशिका की सतह रिसेप्टर्स के लिए बाध्यकारी विष के लिए जिंमेदार हैं । कैसे एक/बी विषाक्त पदार्थों को कुशलतापूर्वक नशीला कोशिकाओं में सक्षम है की हमारी वर्तमान ज्ञान वैज्ञानिकों मौलिक सेलुलर तंत्र को समझने में मदद की, endocytosis और intracellular उच्च युकेरियोटिक कोशिकाओं में छंटाई प्रोटीन की तरह । देखने के एक चिकित्सा बिंदु से, यह इसी तरह के प्रमुख विष तस्करी मार्गों की पहचान करने के लिए रोगियों के लिए पर्याप्त उपचार समाधान खोजने के लिए या अंततः चिकित्सकीय विष विकसित कैंसर थेरेपी के लिए आवेदन आधारित महत्वपूर्ण है ।
के बाद से एक/बी विष स्तनधारी कोशिकाओं में तस्करी के जीनोम चौड़ा विश्लेषण जटिल है, समय लेने वाली, और महंगी, एक/बी विष परिवहन पर कई अध्ययनों खमीर मॉडल जीव Saccharomyces cerevisiaeमें प्रदर्शन किया गया है । कम जटिल होने के बावजूद, मौलिक खमीर और उच्च युकेरियोटिक कोशिकाओं में सेलुलर प्रक्रियाओं समान है और बहुत बार खमीर में प्राप्त परिणाम स्तनधारी स्थिति को हस्तांतरित किया जा सकता है ।
यहां, हम वर्णन एक तेजी से और रिपोर्टर परख का उपयोग करने के लिए खमीर में आरटीए के intracellular तस्करी का विश्लेषण । नए परख का एक आवश्यक लाभ के लिए न केवल आरटीए रेट्रो translocation endoplasmic जालिका से cytosol में (एर) की जांच करने का अवसर है, बल्कि endocytosis और प्लाज्मा झिल्ली से एर में पतित विष परिवहन । परख एक रिपोर्टर प्लाज्मिड कि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के माध्यम से आरटीए विषाक्तता के अप्रत्यक्ष माप की अनुमति देता है का उपयोग करें (GFP) vivo अनुवाद में के बाद । चूंकि आरटीए कुशलतापूर्वक 28S rRNA depurination द्वारा प्रोटीन के संश्लेषण की दीक्षा को रोकता है, इस परख प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में परिवर्तन का पता लगाने के माध्यम से intracellular आरटीए परिवहन में शामिल मेजबान सेल प्रोटीन की पहचान की अनुमति देता है ।
Introduction
विष उत्पादन बैक्टीरिया से संक्रमण से पीड़ित रोगियों को एक सामाजिक स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली के लिए एक गंभीर चिकित्सा और वित्तीय बोझ का प्रतिनिधित्व करते हैं, विशेष रूप से कुशल चिकित्सीय उपचार के बाद से अभी भी काफी हद तक लापता हैं । नई चिकित्सीय रणनीतियों, चिकित्सा प्रासंगिक एक/बी विषाक्त पदार्थों जैसे हैजा विष, शिगा विष, या ricin के जटिल नशा तंत्र विकसित करने के लिए पूरी तरह से आणविक उपंयास शक्तिशाली परख है कि लागू किया जाना है के आधार पर स्तर पर समझने की जरूरत है ।
हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों से खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में समय लेने वाली और लागत जैसे रेडियोधर्मी विष लेबलिंग1,2 के रूप में अच्छी तरह के रूप में सिरना आधारित स्क्रीनिंग का उपयोग करके एक/ 3दृष्टिकोण । कुछ मामलों में, विष तस्करी विवो में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा रासायनिक और के बाद fluorophores, क्वांटम डॉट्स, या फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ व्यक्तिगत विष उपइकाई के आनुवंशिक युग्मन4,5visualized किया गया है । दुर्भाग्य से, इस तरह के संशोधनों अक्सर विषाक्त पदार्थों के निष्क्रिय और/ परोक्ष रूप से वैज्ञानिक प्रश्नों की एक विस्तृत विविधता का जवाब देने के लिए एक और सुरुचिपूर्ण तरीका रिपोर्टर जैसे lacZ, luciferase, या फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे GFP या Discosoma सपाएंजाइमों पर आधारित प्रणालियों का उपयोग है । लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन ( dsRed)) ।
इस पांडुलिपि में, एक सरल प्रोटोकॉल वर्णित है जो सेलुलर घटकों की पहचान करता है intracellular परिवहन के लिए आवश्यक extracellularly लागू आरटीए में S. cerevisiae। जिससे, एक प्रतिदीप्ति-रिपोर्टर प्लाज्मिड एक एन-टर्मिनल ईआर-आयात संकेत युक्त एक प्रोटीन के रूप में GFP कृत्यों द्वारा पीछा किया जाता है, जो परोक्ष रूप से आरटीए में GFP प्रतिदीप्ति उत्सर्जन द्वारा मध्यस्थता प्रोटीन अनुवाद निषेध का उपाय है vivo में अनुवाद6. मामले में है कि आरटीए endocytosis और/या intracellular तस्करी नकारात्मक है (या सकारात्मक) एक विशेष खमीर विलोपन उत्परिवर्ती में जंगली प्रकार की तुलना में प्रभावित है, यह एक वृद्धि (या GFP प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में कमी) के माध्यम से पता लगाया जा सकता है6।
अब तक खमीर कोशिकाओं में आरटीए परिवहन का विश्लेषण करने वाले सभी तरीके आरटीए की ईआर-टू-cytosol रेट्रो-translocation प्रक्रिया तक ही सीमित थे । इस तरह के एक कृत्रिम प्रणाली में, एक ईआर आयात संकेत युक्त आरटीए एक आत्मघाती phenotype1,7में जिसके परिणामस्वरूप एक inducible प्रमोटर से व्यक्त किया जाता है । हालांकि सेल बाध्यकारी बी-ricin के उप इकाई इसी तरह प्रयोगात्मक सेटअप में लापता है इस पांडुलिपि में वर्णित है और, इस प्रकार, पूरी तरह से प्रतिनिधित्व नहीं करता है ricin holotoxin नशे की प्राकृतिक स्थिति8, प्लाज्मा से विष परिवहन एर के लिए Golgi तंत्र के माध्यम से झिल्ली बारीकी से इस उपंयास परख के साथ नकल उतारा जा सकता है । दिलचस्प है, प्रारंभिक पायलट अध्ययन में प्राप्त परिणामों से संकेत मिलता है कि आरटीए द्वारा इस्तेमाल की तस्करी रास्ते ricin holotoxin के नशा मार्ग के साथ हड़ताली समानताएं प्रकट करते हैं ।
संक्षेप में वर्णित विधि में आरटीए endocytosis में चयनित सेलुलर प्रोटीन की विशिष्ट भूमिका और खमीर में तस्करी का निर्धारण किया जा सकता है । इसके अलावा, इस प्रायोगिक सेटअप आसानी से उत्पादित विषाक्त पदार्थों को निष्क्रिय और विभिंन खमीर और बैक्टीरियल प्रजातियों जैसे zymocin या शिगा विष से स्रावित अंय ribosome के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
उपरोक्त प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करते समय, हम प्रयोग के सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित सुझावों की अनुशंसा करते हैं.
heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए, यह 1 मिमी की IPTG एकाग्रता से अधिक नही…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के कुछ हिस्सों को कृपया ड्यूश Forschungsgemeinschaft (SFB १०२७, A6) से अनुदान द्वारा समर्थित थे ।
Materials
| Bacterial and yeast strains | |||
| E coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
Referências
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
