Un'analisi del Reporter di fluorescenza-basata semplice per identificare i componenti cellulari necessari per tossina ricina una catena (RTA) tratta di lievito
Summary
Nel manoscritto, descriviamo l’uso di un’analisi del reporter di fluorescenza basati su lievito per identificare componenti cellulari coinvolti nel traffico e uccidere i processi dei citotossici una subunità della ricina di tossina della pianta (RTA).
Abstract
Batterica e centrale un / tossine B sfruttano le naturali vie di traffico nelle cellule eucariotiche per raggiungere i loro target intracellulare nel citosol e infine uccidere. Un / tossine B consistono generalmente di un enzimaticamente attivo Asubunit (ad es., tossina ricina un (RTA)) e uno o più celle, associazione Bsubunit(s), che sono responsabili di tossina vincolante a specifici recettori di superficie di cella. La nostra attuale conoscenza di come A / B tossine sono in grado di efficientemente inebrianti cellule ha aiutate gli scienziati per comprendere i meccanismi cellulari fondamentali, come endocitosi e proteina intracellulare in cellule eucariotiche superiori. Da un punto di vista medico, allo stesso modo è importante identificare le rotte del narcotraffico tossina principali per trovare soluzioni adeguate di trattamento per i pazienti o per eventualmente sviluppare applicazioni basate su tossina terapeutiche per la terapia del cancro.
Dall’analisi del genoma della A / tossina B traffico in cellule di mammifero è complesso, lungo e costoso, parecchi studi sulla A / trasporto di tossina B sono stati effettuati nell’organismo modello lievito Saccharomyces cerevisiae. Pur essendo meno complessi, fondamentali processi cellulari in lievito e cellule eucariotiche superiori sono simile e molto spesso i risultati ottenuti in lievito possono essere trasferiti alla situazione dei mammiferi.
Qui, descriviamo un’analisi del reporter di veloce e facile da usare per analizzare il traffico intracellulare di RTA in lievito. Un vantaggio essenziale del nuovo test è la possibilità di indagare non solo RTA retrò-traslocazione dal reticolo endoplasmatico (ER) nel citosol, ma piuttosto di endocitosi e retrograda tossina trasporto dalla membrana plasmatica in ER. Il test si avvale di un plasmide del reporter che permette la misura indiretta della tossicità di RTA attraverso l’emissione di fluorescenza della proteina fluorescente verde (GFP) dopo la traduzione in vivo . Poiché RTA previene efficacemente l’inizio della biosintesi della proteina da depurinazione rRNA 28S, questo test consente l’identificazione delle proteine della cellula ospite coinvolti nel trasporto intracellulare di RTA attraverso la rilevazione dei cambiamenti nell’emissione di fluorescenza.
Introduction
Pazienti affetti da infezioni da batteri che producono la tossina rappresentano un grave onere medico e finanziario per ogni sistema di assistenza sanitaria sociale, in particolare quanto efficaci trattamenti terapeutici sono ancora in gran parte mancante. Per sviluppare nuove strategie terapeutiche, i meccanismi complessi intossicazione della medicamente relativi A / tossine B come la tossina del colera, produttore della tossina Shiga o ricina ha bisogno di essere compresa a livello molecolare, basato sul romanzo saggi potente che devono essere implementati.
Negli ultimi anni, diversi studi ha tentato di analizzare A / trasporto di tossina B in lievito e cellule di mammifero usando metodi che richiede tempo e costosa come tossina radioattivo etichettatura1,2 , nonché a screening basato su siRNA si avvicina a3. In alcuni casi, traffico di tossina è stata visualizzata in vivo mediante microscopia a fluorescenza dopo accoppiamento chimico e/o genetico delle subunità di tossina individuali con fluorofori, punti quantici o proteine fluorescenti4,5. Purtroppo, tali modifiche spesso portano a inattivo e/o alterata proprietà naturali delle tossine. Un altro modo elegante per rispondere indirettamente a una vasta gamma di domande scientifiche è l’uso di sistemi reporter basato sugli enzimi come lacZ, luciferasi, o proteine fluorescenti (ad es. GFP o Discosoma sp. (proteina fluorescente rosso dsRed)).
In questo manoscritto, un semplice protocollo è descritto che identifica i componenti cellulari necessari per il trasporto intracellulare di RTA extracellularly applicata in S. cerevisiae. In tal modo, un plasmide di fluorescenza-reporter contenente un segnale N-terminale ER-importazione seguito da GFP agisce come un sensore di biosintesi della proteina, che misura indirettamente l’inibizione di traduzione di RTA-mediato della proteina GFP emissione di fluorescenza dopo in vivo traduzione6. Nel caso che endocitosi RTA e/o traffico intracellulare è influenzata negativamente (o positivamente) in un mutante di delezione di lievito particolare rispetto al wild type, questo può essere rilevato attraverso un aumento (o diminuzione) GFP fluorescenza emissione6.
Finora, tutti i metodi di analisi trasporto RTA in cellule di lievito sono stati limitati al processo retrò-traslocazione ER-a-citosol di RTA. In un sistema così artificiale, RTA contenente un segnale di importazione di ER è espresso da un promotore inducibile, risultante in un fenotipo suicida1,7. Anche se la cella associazione subunità B della ricina similarmente è manca nel setup sperimentale descritto in questo manoscritto e, quindi, non rappresenti perfettamente la situazione naturale di ricina holotoxin intossicazione8, tossina trasporti dal plasma membrana attraverso l’apparato del Golgi al pronto soccorso può essere imitata molto attentamente con questa analisi Novella. Interessante, i risultati preliminari ottenuti nello studio pilota indicano che le vie di traffico utilizzate da RTA rivelano sorprendenti analogie con l’itinerario di intossicazione di ricina holotoxin.
In sintesi, il metodo descritto può essere utilizzato per determinare il ruolo specifico di proteine cellulari selezionati nell’endocitosi RTA e traffico in lievito. Inoltre, questa messa a punto sperimentale potrebbe essere facilmente adattato a altri ribosoma inattivanti tossine prodotto e secreto da diverse specie batteriche come zymocin o tossina Shiga e lievito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quando si esegue il protocollo di cui sopra, si consiglia i seguenti suggerimenti per ottenere un risultato di successo dell’esperimento.
Per l’espressione della proteina eterologa, è importante non superare la concentrazione di IPTG di 1 mM. Concentrazioni di IPTG > 1 mM inibire indotta da promotore espressione di RTA e piombo per abbassare i rendimenti di tossina. Inoltre, le cellule non vanno coltivate a temperature superiori a 28 ° C per impedire la formazione del corpo di inclusione…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Parti di questo studio sono state gentilmente sostenuta da una sovvenzione del Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Bacterial and yeast strains | |||
| E coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
Referências
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