O manuscrito, descreveremos o uso de um ensaio de repórter de fluorescência baseada em fermento para identificar componentes celulares envolvidos no tráfico e matar processos dos citotóxicos uma subunidade da ricina de toxina da planta (RTA).
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Artigo de método
Um ensaio simples repórter baseado em fluorescência para identificar componentes celulares necessários para toxina ricina uma cadeia (RTA) o tráfico de levedura
Neste artigo
Resumo
Resumo
Bacteriana e planta A / toxinas B exploram os caminhos naturais de tráfico em células eucarióticas para alcançar seu alvo (s) intracelular no citosol e, finalmente, matar. Tal A / toxinas B consistem geralmente em um enzimaticamente ativo Asubunit (por exemplo, toxina ricina um (RTA)) e uma ou mais células vinculação Bsubunit(s), que é responsáveis por toxina vinculação específica de receptores de superfície da pilha. Nosso conhecimento atual de como A / B toxinas são capazes de intoxicante eficientemente células ajudados cientistas para entender os mecanismos celulares fundamentais, como a endocitose e proteína intracelular em células eucarióticas superiores. Do ponto de vista médico, é igualmente importante identificar as rotas de tráfico de toxina principais para encontrar soluções de tratamento adequado para pacientes ou eventualmente desenvolver aplicações terapêuticas baseadas em toxina para terapia do câncer.
Desde análises de todo o genoma da / toxina B tráfico em células de mamíferos é complexo, demorado e caro, vários estudos na / transporte de toxina B foram executadas no organismo modelo levedura Saccharomyces cerevisiae. Apesar de ser menos complexos, fundamentais processos celulares em leveduras e células eucarióticas superiores são semelhantes e muitas vezes os resultados obtidos no fermento podem ser transferidos para a situação dos mamíferos.
Aqui, descrevemos um ensaio rápido e fácil de usar do repórter para analisar o tráfico intracelular de RTA em levedura. Uma vantagem essencial do novo ensaio é a oportunidade de investigar não só RTA retrô-translocação do retículo endoplasmático (ER) no citosol, mas prefiro endocitose e toxina retrógrada de transporte da membrana plasmática no pronto-socorro. O ensaio faz uso de um repórter do que permite a medição indirecta de toxicidade de RTA através de emissão de fluorescência da proteína verde fluorescente (GFP) após a tradução na vivo . Desde que o RTA eficientemente impede a iniciação da biossíntese de proteínas por depurinação do rRNA 28S, este ensaio permite a identificação de proteínas de célula de acolhimento envolvidas no transporte intracelular de RTA através da detecção de alterações em emissão de fluorescência.
Introdução
Pacientes que sofrem de infecções pela toxina produzindo bactérias representam um fardo de médico e financeiro grave para cada sistema de saúde social, em particular desde tratamentos terapêuticos eficientes ainda são em grande parte faltando. Para desenvolver novas estratégias terapêuticas, os mecanismos complexos de intoxicação do clinicamente relevante A / toxinas B como toxina da cólera, toxina Shiga ou ricina precisam ser completamente compreendido a nível molecular, baseado no romance poderosos ensaios que devem ser implementadas.
Nos últimos anos, vários estudos tentaram analisar A / transporte de toxina B em leveduras e células de m....
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Protocolo
Nota: Uma visão geral do fluxo de trabalho geral experimental é descrita na Figura 1.
Cuidado: RTA é altamente tóxico para os seres humanos. É necessário permissão do laboratório de segurança S2 (nível de biossegurança 2 equivalente). Por favor, use luvas durante todo o experimento.
1. heteróloga expressão de RTA com sua Tag em Escherichia coli
- Transforme células de Escherichia coli com o expressão do plasmídeo pET24-RTA(seu) 6 ou o vetor vazio pET24a(+) usando o padrão electroporation protocolos9,....
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Resultados
O fluxo de trabalho geral do protocolo descrito neste manuscrito é ilustrado na Figura 1, aproximadamente, resumindo os passos simples para purificação de RTA bem sucedida e o experimento de ensaio de repórter GFP subsequente. Uma descrição mais detalhada de cada etapa individual pode ser encontrada no protocolo. A Figura 2 ilustra o resultado esperado de uma purificação de RTA bem sucedido por cromatografia de afinidade (
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Discussão
Ao executar o protocolo acima, recomendamos as seguintes sugestões para alcançar um resultado bem sucedido do experimento.
Para a expressão da proteína heteróloga, é importante para não exceder a concentração de IPTG de 1 mM. Concentrações de IPTG > 1mm inibir induzida pelo promotor expressão RTA e chumbo para reduzir a produção de toxina. Além disso, as células não devem ser cultivadas em temperaturas acima de 28 ° C para evitar a formação de corpo de inclusão, dobradura ineficiente e ina.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Partes deste estudo foram gentilmente com uma subvenção da Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| cepas bacterianas e de leveduras | |||
| E. coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 mutantes de deleção | Dharmacon | YSC1054 | toda a coleção |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Plasmídeos usados neste protocolo | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3< | ||
| strong>Nome< | strong>Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Reagentes | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | enzima lítica para parede celular remoção |
| LB meio de caldo | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g de ágar foi adicionado para produção de placas |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Sulfato de amônio | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Fermento drop-out mix supplemts sem leucina | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glicose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-rafinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | ||
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PÁGINA régua prestada Fermentas | 26616 | escada de proteína usada para análise ocidental | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo< | strong>Comentários |
| Material para purificação RTA, dessalinização e medições de leitores | |||
| Espectrofotômetro Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | modelo antigo, outros modelos disponíveis | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | modelo antigo, não disponível mais |
| & Auml; KTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Produto foi descontinuado e substituído |
| Coluna HisTRAP HP | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| Coluna de dessalinização HiTRAP | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Filtro estéril Midisart | Sartorius | 16534K | 0.2 µ m tamanho do poro |
| Kit de ensaio de proteína BCA | Pierce | 23225 | |
| Kit de ensaio de 660 nm | Thermo Scientific | 22660 | |
| Placas de 96 poços | Thermo Scientific | 260860 | |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Anticorpos (opcional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | anticorpo primário; diluição 1:1.000 |
| Sigma-Aldrich | A9044-2ML | anti-HRP de camundongo | , diluição 1:10.000 |
Referências
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M.
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Reimpressões e permissões
