Простой на основе флуоресценции репортер проба для выявления клеточных компонентов необходимых для рицин токсинному цепь (RTA) оборота дрожжей
Summary
В рукописи мы описывают использование на основе дрожжей флуоресценции репортер проба для выявления клеточных компонентов, участвующих в торговле и убивать процессы цитотоксических Субблок рицин токсинному завод (RTA).
Abstract
Бактерий и растений A / B токсинов эксплуатировать природные людьми путей в эукариотических клеток для достижения их внутриклеточного ориентация в цитозоле и в конечном итоге убить. Такие A / B токсинов обычно состоят из ферментативно активной Asubunit (например, рицин токсинному (RTA)) и один или несколько ячеек, привязки Bsubunit(s), которые отвечают за токсин, привязки к определенным клеток поверхности рецепторы. Наши текущие знания о том, как A / B токсины способны эффективно опьяняющий клетки помогли ученым понять основных клеточных механизмов, как эндоцитоза и внутриклеточных белков, сортировка в высших эукариотических клеток. С медицинской точки зрения это также важно для выявления маршрутов оборота основных токсин найти решения адекватного лечения для пациентов или в конечном итоге разработать терапевтические токсин основанные применения для терапии рака.
С Анализ генома общесистемной A / B токсин, торговля в клетках млекопитающих является сложным, длительным и дорогостоящим, несколько исследований на A / B токсин транспорта выполнены в организме модель дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Несмотря на то что менее сложной, основных клеточных процессов в дрожжей и высших эукариотических клеток похожи и очень часто результаты, полученные в дрожжи могут быть переданы млекопитающих ситуации.
Здесь мы описываем быстрый и простой в использовании репортер пробирного анализа внутриклеточных торговли РТС в дрожжи. Существенным преимуществом нового анализа является возможность исследовать не только RTA ретро транслокации от эндоплазменный ретикулум (ER) в цитозоль, но скорее эндоцитоза и ретроградным токсин транспорт от плазматической мембраны в ER. Assay делает использование плазмида репортер, который позволяет косвенные измерения токсичности РТС через флуоресценции выбросов зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) после перевода в естественных условиях . Так как RTA эффективно предотвращает начало биосинтеза белка, 28S рРНК депуринизации, этот assay позволяет идентифицировать принимающей ячейки белков участвующих в внутриклеточного транспорта РТС через обнаружение изменений в флуоресценции выбросов.
Introduction
Пациентов, страдающих от инфекций, токсин, бактерий представляют серьезные медицинские и финансовое бремя для каждой социальной системы здравоохранения, в частности, поскольку по-прежнему во многом отсутствуют эффективные лечебные процедуры. Для разработки новых терапевтических стратегий, механизмов комплекса интоксикации медицински соответствующие A / B токсинов, таких как холера токсин, Сига токсин или рицин необходимо полностью понимать на молекулярном уровне на основе романа мощный анализов, которые должны быть реализованы.
В последние годы, несколько исследований попытались проанализировать A / B токсин транспорт в дрожжей и mammalian клеток с помощью длительных и дорогостоящих методов, таких как радиоактивного токсина маркировки1,2 , а также на основе малых интерферирующих РНК скрининг подходы к3. В некоторых случаях токсин людьми был визуализирован в естественных условиях по микроскопии флуоресцирования после химических и/или генетических сцепления отдельных токсин субблоков с флуорофоров, квантовые точки либо флуоресцентные белки4,5. К сожалению таких изменений часто приводят к неактивной и/или измененных природных свойств токсины. Другой элегантный способ ответить косвенно широкий спектр научных вопросов является использование репортер систем на основе ферментов, таких как lacZ, Люцифераза, или флуоресцентные белки (например GFP или Discosoma sp. красный флуоресцирующий белок () dsRed)).
В этой рукописи простой протокол описан, который идентифицирует клеточных компонентов, необходимых для внутриклеточного транспорта внеклеточно прикладной РТС в S. cerevisiae. Таким образом флуоресценции репортер плазмида, содержащие сигнал N-терминальный ER-импорта, следуют GFP выступает в качестве датчика биосинтез белка, который косвенно меры ингибирование перевод RTA-опосредованной белка GFP флуоресценции выбросов после в естественных условиях перевод6. В случае, что RTA эндоцитоз или внутриклеточных торговли отрицательно (или положительное) влияет в мутанта удаления конкретной дрожжей, по сравнению с одичал тип это может быть обнаружена через увеличение (или уменьшение) в GFP флуоресценции выбросов6.
Пока все методы анализа RTA транспорт в дрожжевых клеток были ограничены ER-цитозоль ретро транслокации процесс RTA. В такой системе искусственного РТС, содержащие сигнал импорта ER выражается от индуцибельной промоутер, что приводит к фенотипу суицидальные1,7. Хотя ячейку привязки B-Субблок рицин в экспериментальной установки, описанных в этой рукописи также отсутствует и, таким образом, не представляют собой полностью естественный ситуации рицин holotoxin интоксикации8, токсин транспорт из плазмы мембраны через аппарат Гольджи к ER можно тесно имитировать с этот роман assay. Интересно, что предварительные результаты, полученные в ходе экспериментального исследования указывают, что людьми пути, используемые RTA показывают поразительное сходство с опьянением маршрут рицин holotoxin.
В целом описан метод может использоваться для определения конкретной роли отдельных клеточных белков в RTA эндоцитоза и оборота дрожжей. Кроме того эта экспериментальная установка может легко адаптируется к другим рибосома инактивации токсинов производятся и от различных дрожжей и бактерий видов, таких как zymocin или сига токсин.
Protocol
Representative Results
Discussion
При выполнении вышеупомянутый Протокол, мы рекомендуем следующие предложения для достижения успешных результатов эксперимента.
Для выражения гетерологичных протеина важно не превышать концентрацию IPTG 1 мм. IPTG концентрации > 1 мм подавляют промоутер индуцированной RTA …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Части этого исследования были любезно при поддержке гранта от Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Bacterial and yeast strains | |||
| E coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
Referências
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
