En enkel fluorescens-baserade Reporter analysen identifiera cellulära komponenter krävs för Ricin Toxin en kedja (RTA) handel med jäst
Summary
I manuskript beskriver vi användning av en jäst-baserade fluorescens reporter analysen identifiera cellulära komponenter inblandade i människohandel och döda processer av den cytotoxiska en delenhet av den växt giftet ricin (RTA).
Abstract
Bakteriell och anläggning A / B gifter utnyttja de naturliga människohandel vägarna i eukaryota celler att nå deras intracellulära hanteringspaketobjekt i cytosolen och slutligen döda. Sådan A / B gifter består vanligen av en enzymatiskt aktiva Asubunit (e.g., ricin toxin en (RTA)) och en eller flera cell bindande Bsubunit(s), som är ansvarig för toxin bindning till specifika cell surface receptorer. Vår nuvarande kunskap om hur A / B gifter klarar av att effektivt berusande celler hjälpte forskare för att förstå grundläggande cellulära mekanismer, som endocytos och intracellulära protein sortering i högre eukaryota celler. Från en medicinsk synvinkel är det också viktigt att identifiera de stora toxin handelsvägarna att hitta adekvat behandlingslösningar för patienter eller för att så småningom utveckla terapeutiska toxin-baserade tillämpningar för cancerbehandling.
Sedan genome-wide analyser av A / B toxin människohandel däggdjursceller är komplexa, tidskrävande och dyrt, flera studier på A / B toxin transport har utförts i jäst modell organismen Saccharomyces cerevisiae. Trots att mindre komplex, grundläggande cellulära processer i jäst och högre eukaryota celler kan är liknande och mycket ofta resultat som erhållits i jäst överföras till däggdjur situationen.
Här beskriver vi en snabb och lätt att använda reporter analys för att analysera intracellulära människohandel RTA i jäst. En viktig fördel med nya analysen finns möjlighet att undersöka inte bara RTA retro-translokation från endoplasmatiska retiklet (ER) i cytosolen, men snarare endocytos och retrograd toxin transport från plasmamembranet in i ER. Analysen gör användningen av en reporter plasmid som gör indirekt mätning av RTA toxicitet genom fluorescens utsläpp av grönt fluorescerande protein (GFP) efter i vivo översättning. Eftersom RTA förhindrar effektivt inledandet av proteinbiosynthesisen genom 28S rRNA depurination, möjliggör denna analys identifiering av värd cellproteiner involverade i intracellulära RTA transport genom påvisande av förändringar i fluorescens utsläpp.
Introduction
Patienter som lider av infektioner av toxin producerande bakterier utgör en allvarlig medicinska och ekonomiska börda för varje social hälso-och sjukvårdssystemet, särskilt sedan effektiva terapeutiska behandlingar är fortfarande till stor del saknade. Att utveckla nya terapeutiska strategier, de komplexa berusning mekanismerna av medicinskt relevanta A / B gifter såsom kolera toxin, Shigatoxin eller ricin måste förstås fullt på molekylär nivå baserat på romanen kraftfulla analyser som måste genomföras.
Under senare år har flera studier försökt att analysera A / B toxin transport i jäst och däggdjurs-celler med hjälp av tidskrävande och kostsam metoder såsom radioaktivt toxin märkning1,2 samt siRNA-baserad screening närmar sig3. I vissa fall har toxin människohandel varit visualiseras i vivo genom fluorescensmikroskopi efter kemiska eller genetiska koppling av enskilda toxin subunits med fluorophores, kvantprickar eller fluorescerande proteiner4,5. Tyvärr leda sådana ändringar ofta till inaktiv eller förändrad naturliga egenskaper av gifter. En annan elegant sätt att indirekt svara på en mängd olika vetenskapliga frågor är användningen av reporter system baserade på enzymer såsom Lindholm, luciferas, eller fluorescerande proteiner (t.ex. god Jordbrukarsed eller Discosoma sp. röd fluorescerande protein () dsRed)).
I detta manuskript beskrivs ett enkelt protokoll som identifierar cellulära komponenter som krävs för intracellulär transport av extracellularly tillämpad RTA i S. cerevisiae. Därmed fungerar en fluorescens-reporter plasmid som innehåller en N-terminal ER-import signal följt av GFP som en protein biosyntes sensor, som indirekt mäter RTA-medierad protein översättning hämning av GFP fluorescens utsläpp efter i vivo översättning6. I fall att RTA endocytos eller -intracellulära handel negativt (eller positivt) påverkas i en särskild jäst radering mutant jämfört med vildtyp, kan detta upptäckas genom en ökning (eller minskning) i GFP fluorescens utsläpp6.
Hittills har var alla metoder analysera RTA transport i jästceller begränsade till ER-till-cytosol retro-translokation processen för RTA. I ett sådant system för konstgjorda uttrycks RTA som innehåller en ER importera signal från en inducerbara arrangören vilket resulterar i en självmordsbenägen fenotyp1,7. Även om cellen bindande B-subenheten av ricin saknas jämväl i den experimentella inställning som beskrivs i detta manuskript och, således, fullt representerar inte det naturliga läget av ricin holotoxin berusning8, toxin transport från plasma membran genom Golgi apparaten till ER kan vara nära härmade med denna roman analys. Intressant, indikerar de preliminära resultat som uppnåtts i pilotstudien att människohandel vägar används av RTA avslöjar slående likheter med berusning rutten av ricin holotoxin.
Sammanfattningsvis kan den beskrivna metoden användas för att bestämma den särskilda rollen som valda cellproteiner i RTA endocytos och handel med jäst. Detta experiment kan dessutom anpassas enkelt till andra Ribosomen inactivating toxiner produceras och utsöndras från olika jäst och bakteriearter som zymocin eller Shigatoxin.
Protocol
Representative Results
Discussion
När du utför det ovanstående protokollet, rekommenderar vi följande förslag att uppnå ett framgångsrikt resultat av experiment.
För heterologa proteinuttryck är det viktigt att inte överskrida IPTG koncentrationen av 1 mM. IPTG koncentrationer > 1 mM hämmar arrangören-inducerad RTA uttryck och leda till lägre toxin avkastning. Dessutom bör celler inte odlas vid högre temperaturer än 28 ° C att förhindra inkludering kroppen bildandet, ineffektiva vikning och toxin inaktive…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Delar av denna studie var vänligt stöds av ett bidrag från den Deutsche Forschungsgemeinschafts (SFB 1027, A6).
Materials
| Bacterial and yeast strains | |||
| E coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
Referências
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
