Um ensaio simples repórter baseado em fluorescência para identificar componentes celulares necessários para toxina ricina uma cadeia (RTA) o tráfico de levedura
Summary
O manuscrito, descreveremos o uso de um ensaio de repórter de fluorescência baseada em fermento para identificar componentes celulares envolvidos no tráfico e matar processos dos citotóxicos uma subunidade da ricina de toxina da planta (RTA).
Abstract
Bacteriana e planta A / toxinas B exploram os caminhos naturais de tráfico em células eucarióticas para alcançar seu alvo (s) intracelular no citosol e, finalmente, matar. Tal A / toxinas B consistem geralmente em um enzimaticamente ativo Asubunit (por exemplo, toxina ricina um (RTA)) e uma ou mais células vinculação Bsubunit(s), que é responsáveis por toxina vinculação específica de receptores de superfície da pilha. Nosso conhecimento atual de como A / B toxinas são capazes de intoxicante eficientemente células ajudados cientistas para entender os mecanismos celulares fundamentais, como a endocitose e proteína intracelular em células eucarióticas superiores. Do ponto de vista médico, é igualmente importante identificar as rotas de tráfico de toxina principais para encontrar soluções de tratamento adequado para pacientes ou eventualmente desenvolver aplicações terapêuticas baseadas em toxina para terapia do câncer.
Desde análises de todo o genoma da / toxina B tráfico em células de mamíferos é complexo, demorado e caro, vários estudos na / transporte de toxina B foram executadas no organismo modelo levedura Saccharomyces cerevisiae. Apesar de ser menos complexos, fundamentais processos celulares em leveduras e células eucarióticas superiores são semelhantes e muitas vezes os resultados obtidos no fermento podem ser transferidos para a situação dos mamíferos.
Aqui, descrevemos um ensaio rápido e fácil de usar do repórter para analisar o tráfico intracelular de RTA em levedura. Uma vantagem essencial do novo ensaio é a oportunidade de investigar não só RTA retrô-translocação do retículo endoplasmático (ER) no citosol, mas prefiro endocitose e toxina retrógrada de transporte da membrana plasmática no pronto-socorro. O ensaio faz uso de um repórter do que permite a medição indirecta de toxicidade de RTA através de emissão de fluorescência da proteína verde fluorescente (GFP) após a tradução na vivo . Desde que o RTA eficientemente impede a iniciação da biossíntese de proteínas por depurinação do rRNA 28S, este ensaio permite a identificação de proteínas de célula de acolhimento envolvidas no transporte intracelular de RTA através da detecção de alterações em emissão de fluorescência.
Introduction
Pacientes que sofrem de infecções pela toxina produzindo bactérias representam um fardo de médico e financeiro grave para cada sistema de saúde social, em particular desde tratamentos terapêuticos eficientes ainda são em grande parte faltando. Para desenvolver novas estratégias terapêuticas, os mecanismos complexos de intoxicação do clinicamente relevante A / toxinas B como toxina da cólera, toxina Shiga ou ricina precisam ser completamente compreendido a nível molecular, baseado no romance poderosos ensaios que devem ser implementadas.
Nos últimos anos, vários estudos tentaram analisar A / transporte de toxina B em leveduras e células de mamíferos usando métodos demorados e onerosos como toxinas radioactivas rotulagem1,2 , bem como a triagem de siRNA-baseado aproxima-se3. Em alguns casos, toxina tráfico tem sido visualizada na vivo por microscopia de fluorescência após acoplamento químico e/ou genético de subunidades de toxina individual com fluorophores, pontos quânticos ou proteínas fluorescentes4,5. Infelizmente, tais modificações muitas vezes levam a inativas e/ou alteradas propriedades naturais das toxinas. Outra maneira elegante de responder indiretamente uma grande variedade de questões científicas é a utilização de sistemas de repórter baseados em enzimas como lacZ, luciferase, ou proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP ou Discosoma sp. (proteína fluorescente vermelha dsRed)).
Neste manuscrito, um simples protocolo é descrito que identifica celulares componentes necessários para o transporte intracelular de RTA extracelularmente aplicada no S. cerevisiae. Desse modo, um plasmídeo de fluorescência-repórter contendo um sinal de N-terminal ER-importação seguido de GFP funciona como um sensor de biossíntese de proteínas, que mede indiretamente a inibição da tradução de proteínas mediada por RTA por GFP fluorescência emissão após in vivo tradução6. No caso que endocitose RTA e/ou tráfico intracelular é negativa (ou positiva) afetado em um mutante de levedura especial exclusão em relação ao tipo selvagem, isto pode ser detectado através de um aumento (ou diminuição) na GFP de emissão de fluorescência6.
Até agora, todos os métodos de análise de transporte de RTA em células de levedura foram restringidos ao processo de translocação retrô ER-para-citosol de RTA. Em um sistema artificial, RTA contendo um sinal de importação ER é expressa de um promotor inducible, resultando em um fenótipo suicida1,7. Embora a célula de ligação B-subunidade de ricina desapareceu da mesma forma na instalação experimental descrita neste manuscrito e, assim, não totalmente representa a situação natural de ricina holotoxin intoxicação8, transporte de toxina do plasma membrana através do aparelho de Golgi ao pronto-socorro pode ser imitada estreitamente com este ensaio de romance. Curiosamente, os resultados preliminares obtidos no estudo piloto indicam que as vias de tráfico usadas pelo RTA revelam semelhanças marcantes com a via de intoxicação de ricina holotoxin.
Em resumo, o método descrito pode ser usado para determinar o papel específico das proteínas celulares selecionadas em endocitose RTA e do tráfico de levedura. Além disso, esta configuração experimental pode ser facilmente adaptada para outra Ribossoma inactivar as toxinas produzidas e secretadas de vários espécies de leveduras e bactérias como zymocin ou toxina Shiga.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ao executar o protocolo acima, recomendamos as seguintes sugestões para alcançar um resultado bem sucedido do experimento.
Para a expressão da proteína heteróloga, é importante para não exceder a concentração de IPTG de 1 mM. Concentrações de IPTG > 1mm inibir induzida pelo promotor expressão RTA e chumbo para reduzir a produção de toxina. Além disso, as células não devem ser cultivadas em temperaturas acima de 28 ° C para evitar a formação de corpo de inclusão, dobrad…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partes deste estudo foram gentilmente com uma subvenção da Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Bacterial and yeast strains | |||
| E coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
Referências
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